Kirurgisk ablation analys för att studera ögon Regeneration i Planarians

Summary

Detta protokoll visar hur man konsekvent excidera planarian ögon (optiska koppar) utan att störa omgivande vävnader. Med användning av en insulin nål och spruta, antingen den ena eller båda ögonen kan ablateras för att underlätta undersökningar av de mekanismer som reglerar ögonregenere, utvecklingen av visuell regenerering, och den neurala grunden för Ijusinducerad beteende.

Abstract

I studien av vuxna stamceller och regenerativa mekanismer, planarian Plattmaskar är en stapel in vivo modellsystem. Detta beror till stor del på deras rikliga pluripotenta stamcellspopulationen och förmåga att regenerera alla cell- och vävnadstyper efter skador som skulle vara katastrofalt för de flesta djur. Nyligen har planarians vunnit popularitet som en modell för ögat förnyelse. Deras förmåga att regenerera hela ögat (bestående av två vävnadstyper: pigmentceller och fotoreceptorer) medger dissektion av de mekanismer som reglerar visuella systemet regenerering. Ögon ablation har flera fördelar jämfört med andra tekniker (såsom halshuggning eller hålstans) för behandlingen av ögonspecifika vägar och mekanismer, den viktigaste av dessa är att regenerering är till stor del begränsad till enbart ögonvävnader. Syftet med den här videon artikel är att visa hur tillförlitligt att ta bort planarian optisk cup utan att störa hjärnan eller omgivande vävnader.Hanteringen av maskar och underhåll av en etablerad koloni beskrivs också. Denna teknik använder en 31 G, 5/16 tum insulin nål för att kirurgiskt ösa ut den optiska kopp planarians immobiliserade på en kall platta. Denna metod omfattar både enkel och dubbel ögon ablation, med ögonen regenere inom 1-2 veckor, vilket möjliggör ett brett spektrum av applikationer. I synnerhet kan denna ablation teknik enkelt kombineras med farmakologiska och genetiska (RNA-interferens) skärmar för en bättre förståelse av regenerativa mekanismer och deras utveckling, ögon stamceller och deras underhåll och phototaxic beteendereaktioner och deras neurologiska basis.

Introduction

Planarians är en kraftfull modellorganism för att studera adulta stamceller medierad förnyelse. Dessa icke-parasitiska sötvattensplattmaskar besitter förmågan att regenerera alla eventuella saknade vävnader, inklusive deras centrala nervsystemet och hjärnan ^en. Studerats så långt tillbaka som 1700-talet ^2, de tekniska framstegen i planarian fältet under de senaste 10-15 åren (såsom ett sekvenserat genom, hybridisering in situ, immunohistokemi, RNA-interferens (RNAi), och transkriptomik) har uppdaterat denna historiska modellorganism . Specifikt har planarians nyligen vunnit popularitet som en framväxande modell för ögonforskning ^3.

Planarians har prototypiska ögon med endast två vävnadstyper, fotoreceptor neuroner och pigmentceller; detta har möjliggjort karakteriseringen av dess ögonstamcellspopulation och visade att många av samma gener som reglerar vertebrat ögon deveckling är konserverade i planarians ^{4, 5.} De optiska koppar är belägna dorsalt och består av de vita, opigmenterade dendriter av fotoreceptor nervceller och de halv månens svart pigmentceller, och ögonen innerverar hjärnan via en optisk chiasm. Förutom att vara en modell för att belysa regenerativa processer ^6, är väl lämpad för att studera utvecklingen av visuella mekanismer ⁷ den planarian ögat, beteendemässiga reaktioner för ljus (planarians uppvisar negativa phototaxis) ^8, och den neurologiska grundval av beteende ^9.

Ögonregenerering i planarians har till stor del undersökts i två huvud sammanhang: som en del av huvudregenerering efter dekapitering ^{4, 10,} och efter excision av bara ögonvävnaderna ^{11, 12} </sup>. De flesta planarian studier på ögon regeneration har använt halshuggning metoden, eftersom det är enkelt och okomplicerat. Den vanligaste planarian öga excision metod har hittills varit via hål med ett fint glas kapillärrör ^{13, 14,} även om vissa studier har också utförts amputationer strax bakom ögonen (partiell halshuggning) ^15. Men alla dessa metoder innebär förlusten av många andra än bara ögat vävnader (t.ex. hjärna, tarmar och nephridia), potentiellt komplicerande tolkning av resultaten. Ögat ablation Protokollet presenteras här begränsar excision till ögonvävnaderna (specifikt exklusive hjärnan), vilket resulterar i data som är mer specifika för ögat. Dessutom, till skillnad dekapiterade maskar som tar 7-14 dagar för att påbörja matning, kommer ögon ablateras maskar foder inom 24 h från ablation ^12, vilket tillåter RNAi-experiment (där RNAi levereras via mat) som skall performed samtidigt.

Även ögon ablation är tekniskt svårare att framgångsrikt utföra än halshuggning, har aktuella studier som involverar ögat excision som inte ingår detaljerade instruktioner om sina rutiner. Målet med den här videon artikel är att göra det möjligt för forskare att konsekvent ta bort planarian optisk cup utan att störa de underliggande hjärnvävnad och ta bort så få andra vävnader som möjligt. Denna metod kan användas för både dubbel och enkel ögon ablation och kan tillämpas på ett brett spektrum av undersökningar. Liksom de flesta regenereringsanalyser är ögon ablation väl lämpad för kombination med både farmakologiska och genetiska (RNAi) skärmar, samt beteendestudier. Här beskriver vi metoder för hantering av maskar, upprätthålla en planarian koloni, och ögat ablation tekniken i sig.

Protocol

1. Animaliska Kultur och Hantering OBS: Detta protokoll använder Schmidtea mediterranea, en diploid planarian arter med ett sekvenserat genomet 16, 17 som ofta används för regenerering forskning. Emellertid är analysen lika framgångsrika med andra arter, såsom Dugesia tigrina och dugesia dorotocephala (som är kommersiellt tillgängliga). Upprätthålla maskar i "masken vatten&…

Representative Results

För första 1-2 timmar efter operation, kan djuren uppvisar minskad rörelse jämfört med intakta maskar (men de kommer fortfarande att röra sig). Om så önskas, kommer maskar äta inom 24 h av kirurgi (exempelvis för RNAi utfodring). När efter ögon förnyelse i samma individer över tid, se till att ta ett fotografi av varje mask både före operationen (intakt) och vid en timmar efter ablation (HPA). Av 4 dagar efter ablation (dpa) regenererande pigmentceller ska vara synliga, o…

Discussion

Detta öga ablation teknik förbättrar på nuvarande metoder (såsom hålslag) genom exklusive hjärnvävnader och begränsa excision huvudsakligen ögonvävnaderna. Med lite övning kan denna teknik utföras av de flesta individer, från tekniker med erfarenhet av microsurgeries till oerfarna men samvetsgranna studenter. Det rekommenderas att denna teknik praktiseras många gånger före användning ablationer i experiment, inklusive (om möjligt) bekräftelse av fullständigt avlägsnande av alla ögonvävnader genom…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional