Spændingsklemme Fluorometri i<em> Xenopus</em> Oocytter ved hjælp af fluorescerende unaturlige aminosyrer
Summary
Denne artikel beskriver en forbedring af konventionel spændingsklemmefluorometri (VCF), hvor fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA) anvendes i stedet for maleimidfarvestoffer til sondring af strukturelle omlejringer i ionkanaler. Fremgangsmåden indbefatter Xenopus oocyt DNA-injektion, RNA / fUAA-coinjection og samtidige strøm- og fluorescensmålinger.
Abstract
Spændings-clamp Fluorometry (VCF) har været den valgte teknik til at undersøge strukturen og funktionen af elektrogeniske membranproteiner, hvor realtidsmålinger af fluorescens og strømme samtidig rapporterer om lokale omlejringer og global funktion henholdsvis 1 . Mens højopløsningsstrukturteknikker, såsom kryo-elektronmikroskopi eller røntgenkrystallografi, tilvejebringer statiske billeder af proteiner af interesse, giver VCF dynamiske strukturelle data, der tillader os at forbinde strukturelle omlejringer (fluorescens) til dynamiske funktionelle data (elektrofysiologi). Indtil for nylig har den thiolreaktive kemi, der blev anvendt til lokalitetsstyret fluorescerende mærkning af proteinerne, begrænset omfanget af tilgangen, fordi alle tilgængelige cysteiner, herunder endogene, vil blive mærket. Det var således påkrævet at konstruere proteiner fri for endogene cysteiner. Mærkning var også begrænset til steder, der var tilgængelige fra det ekstracellulæreside. Dette ændrede sig ved anvendelse af fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA) til specifikt at inkorporere en lille fluorescerende probe som reaktion på stopkodonundertrykkelse ved anvendelse af et ortogonalt tRNA og tRNA syntetasepar 2 . VCF-forbedringen kræver kun en to-trins injektionsprocedure af DNA-injektion (tRNA / syntetasepar) efterfulgt af RNA / fUAA-co-injektion. Nu er mærkning af både intracellulære og begravede steder mulig, og brugen af VCF er blevet udvidet betydeligt. VCF-teknikken bliver derved attraktiv til at studere en bred vifte af proteiner og – vigtigere – muliggør undersøgelse af mange cytosoliske reguleringsmekanismer.
Introduction
Over 200 unaturlige aminosyrer med forskellige kemiske og fysiske egenskaber er blevet genetisk inkorporeret i proteiner i E. coli , gær og pattedyrsceller 3 . Den unaturlige aminosyre inkorporeres som reaktion på et specifikt stopkodon via et ortogonalt konstrueret tRNA / syntetasepar. Den genetiske tilgang til modifikation af proteiner har givet værdifulde indsigter i proteinstruktur og funktion. Her præsenterer vi en protokol for anvendelse af spændings-clamp fluorometri (VCF) i kombination med en fluorescerende UAA.
I VCF giver den samtidige observation af funktionelle data og strukturelle omlejringer lokaliseret omkring den fluorescerende sonde (~ 5 Å) os mulighed for at opnå dynamisk information med millisekund opløsning 1 . De fluorescerende prober ændrer deres slukningstilstand ved lokaliseret bevægelse af proteinet. En bevægelse på kun 1-2 Å er tilstrækkelig til at føre til signifikante ændringer i fluorescensenIntensitet 4 . Efter identifikation af stedet af interesse i målproteinet, er stedet muteret ved punktmutation. Klassisk havde resten været muteret til en cystein, medens nu introduceres et ravstopkodon (TAG) til genetisk fUAA-inkorporering. Proteinet transkriberes derefter in vitro .
Mens andre ekspressionssystemer ( f.eks. Pattedyrsceller) kan anvendes 5 , 6 , 7 , foretrækkes Xenopus- oocytter for strukturfunktionsstudier på grund af deres større størrelse, hvilket fører til lettere manipulation og højere fluorescensintensitet (mere fluoroforer) Støjforhold. Desuden har Xenopus oocytter lav baggrund fra endogene proteiner 2 , 8 og den mørke pigmentering på dyrepolskærme mod baggrundsfluorescens fra tHan cytosol. Xenopus- oocytterne fjernes kirurgisk, og DNA kodende for det ortogonale tRNA / tRNA-syntetasepar, der er specifikt for fUAA, injiceres i kernen af oocytterne. Efter en 6-24 h inkubationstid co-injiceres protein RNA med fUAA i cytosolet i oocytterne efterfulgt af en 2-3 dages inkubationsperiode. For at forhindre skade på fUAA (fotoblegning) skal procedurerne herunder Anap udføres under rødt lys for at undgå fluoroforekspitering.
Oocytter studeres på en åbent oocyt spændingsklemmeopsætning, som er monteret på et opretstående fluorescensmikroskop, og elektriske strøm- og fluorescensændringer registreres samtidigt 9 , 10 . Alternativt kan toelektrodspændingsklemme 1 eller patch-clampkonfigurationer 11 anvendes. Fluorescens er ophidset af passende bølgelængder med lav RMS støj og Emission registreret ved anvendelse af en fotodiode forbundet til en forstærker med høj amplifikation.
Der er flere fordele ved at anvende fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA'er) i spændingsklemmefluorometri. Den ene er adgang til den cytosoliske side af membranproteinerne; Mange reguleringsprocesser er placeret her ( f.eks. Ca 2+ – eller nukleotidbindingssteder, hurtig og lukket tilstand inaktivering af spændingsgatede ionkanaler, poreåbning, modulkobling). Alle disse processer er nu tilgængelige for fluorescerende mærkning.
En anden fordel er probens lille størrelse, der fører til mindre forstyrrelse af proteinet. Hidtil er to ortogonale tRNA / tRNA syntetasepar til fUAA'er blevet konstrueret 12 , 13 , hvor 3- (6-acetylnaphthalen-2-ylamino) -2-aminopropansyre (Anap) er den eneste fUAA, der er blevet anvendt i Xenopus- oocytter 2 ,"Xref"> 8. Anap er en miljømæssig følsom fluorofor med en molekylvægt på 272,3 g / mol og er kun lidt større end tryptophan 12 ( figur 1A, 1B ). På grund af sin lille størrelse er det sandsynligvis, at færre steriske virkninger introduceres af fluoroforen sammenlignet med konventionelle fluoroforer, der er fæstnet via en linker (typisk mere end 500 g / mol). Desuden ligger fluoroforen i tilfælde af Anap tættere på proteinhvirvelen end de, der er forbundet med cystein, og følgelig undersøger Anap flere lokaliserede omlejringer. Endelig er fjernelse af endogene cysteiner i konventionel VCF for at sikre stedsspecifik mærkning ikke længere et krav i UAA-VCF, og derfor (i) efterlader proteinerne i (næsten) deres oprindelige tilstand og (ii) tillader VCF at blive anvendt At studere et bredere udvalg af proteiner, hvor funktionen kan ændres ved cysteinsubstitution.
<img alt="figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
Figur 1 : Anap- og fluorescensspektra. ( A ) Kemisk struktur af Anap. ( B ) Normaliseret absorptionsspektrum og emissionsspektre for 1 nM Anap, der demonstrerer følsomheden af Anap fluorescens til opløsningsmiddelhydrofobiciteten. Emissionsspektre blev opnået ved spænding ved 350 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
En ulempe ved at anvende fluorescerende UAA'er er, at en heterogen population af proteiner kan resultere i stopkodon-gennemlæsning, translationel reinitiation, C-terminale trunkerede proteiner eller crosstalk med endogen aminacylering, hvis mængden af aminoacylerede tRNA'er er knappe. Sådant lækageekspres bør altid kontrolleres i fravær af fUAA og tRNA / tRNA syntetaseparet. Vi behandlede spørgsmålet om transLational reinitiation og hvordan man omgå det for N-terminale indsættelsessteder tidligere 14 . Når fUAA-, tRNA- og tRNA-syntetasen er til stede i mættede mængder, forbliver der imidlertid kun en lav sandsynlighed for lækageudtryk.
Den centrale proceduremæssige forskel mellem fUAA-VCF og konventionel VCF er injektion og håndtering af oocytterne; Injektionen af DNA kodende for tRNA og tRNA syntetase (pAnap) efterfølges af introduktionen af Anap, som enten co-injiceres med protein mRNA eller alternativt tilsættes til inkubationsopløsningen som en acetoxymethyl (AM) ester.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo aminoacyleringen af tRNA'er, som kontinuerligt transkriberes sammen med tRNA-syntetasen, gør det muligt at opnå høje ekspressionsniveauer for fluorescensmålinger. Til effektiv fUAA-inkorporering er det kritisk, at pAnap injiceres korrekt i kernen. På grund af usikkerheden om den nøjagtige placering af kernen forventes 10-40% af DNA-injektionerne at mislykkes, hvilket resulterer i ikke-ekspression (eller lækageudtrykkende) oocytter. Derfor er det vigtigt at kontrollere udtryk i mangel af…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap var en venlig gave fra Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Dette arbejde blev finansieret af de canadiske institutter for sundhedsforskningstilskud MOP-102689 og MOP-136894 (til RB) og Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
Riferimenti
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
