Spänningsklämma Fluorometry in<em> Xenopus</em> Oocyter Användande Fluorescerande Onaturliga Aminosyror
Summary
I denna artikel beskrivs en förbättring av konventionellt spänningsklämma-fluorometri (VCF) där fluorescerande onaturliga aminosyror (fUAA) används istället för maleimidfärger för att sondra strukturella omläggningar i jonkanaler. Förfarandet innefattar Xenopus oocyt DNA-injektion, RNA / fUAA-myntutjämning och samtidiga ström- och fluorescensmätningar.
Abstract
Spänningsklämma-fluorometri (VCF) har varit den valfria tekniken för att undersöka strukturen och funktionen hos elektrogena membranproteiner där realtidsmätningar av fluorescens och strömmar samtidigt rapporterar om lokala omläggningar och global funktion respektive 1 . Medan högupplösande strukturtekniker, såsom kryo-elektronmikroskopi eller röntgenkristallografi, tillhandahåller statiska bilder av proteinerna av intresse, tillhandahåller VCF dynamiska strukturella data som gör att vi kan koppla strukturella omläggningar (fluorescens) till dynamiska funktionella data (elektrofysiologi). Fram till nyligen begränsades den tiolreaktiva kemi som användes för ställningsinriktad fluorescerande märkning av proteinerna begränsningen av tillvägagångssättet, eftersom alla tillgängliga cysteiner, inklusive endogena, kommer att märkas. Det var således nödvändigt att konstruera proteiner fria från endogena cysteiner. Märkning var också begränsad till platser som var tillgängliga från extracelluläretsida. Detta förändrades med användning av fluorescerande onaturliga aminosyror (fUAA) för att specifikt införliva en liten fluorescerande prob som svar på stoppkodonundertryckning med användning av ett ortogonalt tRNA och tRNA syntetaspar 2 . VCF-förbättringen kräver endast ett tvåstegsinjektionsförfarande för DNA-injektion (tRNA / syntetaspar) följt av RNA / fUAA-saminjektion. Nu är det möjligt att märka både intracellulära och begravda platser, och användningen av VCF har expanderat avsevärt. VCF-tekniken blir därmed attraktiv för att studera ett brett spektrum av proteiner och – än viktigare – möjliggör undersökning av många cytosoliska regulatoriska mekanismer.
Introduction
Över 200 onaturliga aminosyror med olika kemiska och fysikaliska egenskaper har införlivats genetiskt i proteiner i E. coli , jäst och däggdjursceller 3 . Den onaturliga aminosyran inkorporeras som svar på ett specifikt stoppkodon via ett ortogonalt konstruerat tRNA / syntetaspar. Det genetiska sättet att modifiera proteiner har gett värdefulla insikter i proteinstruktur och funktion. Här presenterar vi ett protokoll för användning av Spänning-Clamp Fluorometry (VCF) i kombination med en fluorescerande UAA.
I VCF tillåter simultan observation av funktionella data och strukturella omläggningar lokaliserade runt den fluorescerande proben (~ 5 Å) att vi erhåller dynamisk information med millisekundupplösning 1 . De fluorescerande proberna ändrar sitt släckande tillstånd vid lokaliserad rörelse av proteinet. En rörelse av endast 1-2 Å är tillräcklig för att leda till signifikanta förändringar i fluorescensenIntensitet 4 . Efter identifiering av den aktuella platsen i målproteinet muteras stället genom punktmutation. Klassiskt hade resten blivit muterad till en cystein medan nu ett ravstoppkodon (TAG) införs för genetisk fUAA-inkorporering. Proteinet transkriberas därefter in vitro .
Medan andra expressionssystem ( t.ex. däggdjursceller) kan användas 5 , 6 , 7 , föredrar Xenopus- oocyter för strukturfunktionsstudier på grund av deras större storlek, vilket leder till enklare manipulation och högre fluorescensintensitet (mer fluoroforer) och därför Bullerförhållande. Vidare har Xenopus- oocyter låg bakgrund från endogena proteiner 2 , 8 och den mörka pigmenteringen på djurpolsköldarna mot bakgrundsfluorescens från tHan cytosol. Xenopus- oocyterna avlägsnas kirurgiskt och DNA kodande för det ortogonala tRNA / tRNA-syntetasparet specifikt för fUAA injiceras i kärnan hos oocyterna. Efter en 6-24 h inkubationstid injiceras protein RNA med fUAA in i cytosolen hos oocyterna följt av en inkubationsperiod på 2-3 dygn. För att förhindra skador på fUAA (fotobildning) måste procedurerna inklusive Anap utföras under rött ljus för att undvika fluorofor excitation.
Oocyter studeras på en skärmad oocytspännings-klämuppsättning, vilken är monterad på ett upprätt fluorescensmikroskop, och elektriska ström- och fluorescensförändringar registreras samtidigt 9 , 10 . Alternativt kan tvåelektrodspänningsklämma 1 eller patch-clamp-konfigurationer 11 användas. Fluorescens är upphetsad av lämpliga våglängder med låg RMS-brus och Utsläpp som registrerats med användning av en fotodiod kopplad till en förstärkare med hög amplifiering.
Det finns flera fördelar med att använda fluorescerande onaturliga aminosyror (fUAAs) i spännings-klämfluorometri. En är tillgång till den cytosoliska sidan av membranproteinerna; Många regleringsprocesser finns här ( t.ex. Ca 2+ – eller nukleotidbindningsställen, snabb och sluten inaktivisering av spänningsdämpade jonkanaler, poröppning, modulkoppling). Alla dessa processer är nu tillgängliga för fluorescerande märkning.
En annan fördel är sondens lilla storlek vilket leder till mindre störning av proteinet. Hittills har två ortogonala tRNA / tRNA syntetaspar för fUAAs konstruerats 12 , 13 , där 3- (6-acetylnaftalen-2-ylamino) -2-aminopropansyra (Anap) är den enda fUAA som har använts i Xenopus- oocyter 2 ,"Xref"> 8. Anap är en miljökänslig fluorofor med en molekylvikt av 272,3 g / mol och är endast något större än tryptofan 12 (figurerna 1A, 1B ). På grund av sin lilla storlek kommer färre steriska effekter sannolikt att införas av fluoroforen jämfört med konventionella fluorforer kopplade via en länkare (vanligen mer än 500 g / mol). Vidare, när det gäller Anap, ligger fluoroforet närmare proteinkrockbenet än de som är kopplade till cysteiner, och följaktligen undersöker Anap mer lokaliserade omläggningar. Slutligen, avlägsnande av endogena cysteiner i konventionell VCF för att säkerställa platsspecifik märkning är inte längre ett krav i UAA-VCF och därför (i) lämnar proteinerna i (nästan) deras ursprungsstatus och (ii) tillåter VCF att appliceras Att studera ett bredare spektrum av proteiner, i vilka funktion kan förändras genom cysteinsubstitution.
<img alt="Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg" />
Figur 1 : Anap och fluorescensspektra. ( A ) Anapens kemiska struktur. ( B ) Normaliserat absorptionsspektrum och emissionsspektra för 1 nM Anap, vilket demonstrerar känsligheten hos Anap-fluorescens mot lösningsmedelshydrofobiciteten. Emissionsspektra erhölls genom spänning vid 350 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
En nackdel med att använda fluorescerande UAA: er är att en heterogen population av proteiner kan vara följd av stoppkodonavläsning, translationell reinitiation, C-terminala trunkerade proteiner eller crosstalk med endogen aminoacylering om mängden av aminoacylerade tRNAs är knappa. Ett sådant läckagexpression bör alltid kontrolleras i frånvaro av fUAA och tRNA / tRNA syntetasparet. Vi tog upp frågan om transLational reinitiation och hur man kringgår den för N-terminala insättningsställen tidigare 14 . När fUAA, tRNA och tRNA-syntetas är närvarande i mättade mängder kvarstår emellertid endast en låg sannolikhet för läckagexpression.
Den viktigaste procedurskillnaden mellan fUAA-VCF och konventionell VCF är injektionen och hanteringen av oocyterna; Injektionen av DNA som kodar för tRNA och tRNA-syntetas (pAnap) följs av införandet av Anap, som antingen co-injiceras med protein-mRNA eller alternativt sättes till inkubationslösningen som en acetoximetyl (AM) ester.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo- aminoacyleringen av tRNA som kontinuerligt transkriberas tillsammans med tRNA-syntetas gör det möjligt att erhålla höga expressionsnivåer för fluorescensmätningar. För effektiv fUAA-inkorporering är det kritiskt att pAnap injiceras korrekt i kärnan. På grund av osäkerheten om kärnans exakta position förväntas 10-40% av DNA-injektionerna misslyckas, vilket resulterar i icke-uttryckande (eller läckande uttryckande) oocyter. Därför är det viktigt att kontrollera uttryck i frånvaro av A…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap var en snäll present från Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Detta arbete finansierades av de kanadensiska instituten för hälsovetenskapliga bidrag MOP-102689 och MOP-136894 (till RB) och kanadensiska stiftelsen för innovationsbidrag 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
Riferimenti
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
