وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mCD1d في خلايا الحشرات.
Summary
طريقة لتحضير خلايا الحشرات والعدوى لهم الفيروسة العصوية للغرض من إنتاج المؤتلف proteinand mCD1d توليد tetramers mCD1d.
Abstract
CD1 البروتينات تشكل الطبقة الثالثة من مستضد تقديم الجزيئات. هم جليكوبروتينات سطح الخلية ، كما عبر عنها سلاسل الثقيلة حوالي 50 كيلو دالتون الغليكوزيلاتي التي ترتبط مع noncovalently المكروغلوبولين beta2 -. انهم ربط الدهون بدلا من الببتيدات. على الرغم من بنيتها يؤكد تشابه البروتينات CD1 MHC إلى الصف الأول والجزيئات الدرجة الثانية تقديم المستضد ، الأخدود mCD1d ضيقة نسبيا ، وعميقة ، ومسعور جدا وفقد اثنين من جيوب ملزم بدلا من جيوب الضحلة الموصوفة لعدة الكلاسيكية MHC – ترميز مستضد تقديم الجزيئات. بناء على تسلسل هذه الأحماض الأمينية ، وهذا الأخدود hydrobphobic يوفر بيئة مثالية لربط مستضدات الدهون.
من الطبيعي القاتل T (NKT) استخدام الخلايا TCR على الاعتراف glycolipids ملزمة أو قدمها CD1d. وقد شاركت الخلايا التائية المتفاعلة إلى الدهون التي قدمها CD1 في الحماية ضد الأمراض المعدية والمناعة الذاتية ورفض في الورم. وبالتالي ، فإن القدرة على تحديد وتطهير ، وتتبع استجابة الخلية NKT CD1 التفاعل ذو أهمية كبيرة. جيل tetramers ألفا Galactosyl سيراميد (A – Galcer) مع CD1d وبصيرة هامة في بيولوجيا الخلايا NKT. Tetramers مصنوعة من جزيئات CD1 الأخرى كما تم إنشاؤها وهذه الكواشف الجديدة قد وسعت كثيرا من المعارف وظائف الخلايا التائية الدهون التفاعل ، مع إمكانية استخدامها في رصد استجابة لدهن المستندة إلى اللقاحات وفي تشخيص أمراض المناعة الذاتية وغيرها العلاجات.
Protocol
Discussion
في هذا الإجراء ، فإنه يظهر كيفية بدء وينمون وتصيب خلايا الحشرات وكيفية عيار الفيروسة العصوية في استخدام هذه الخلايا. وأهم جوانب هذا الإجراء وصيانة الخلايا ومعرفة عيار الدقيق للالفيروسة العصوية. ذات مرة كنت قد ولدت CD1 tetramers ، يمكن استخدامها كأداة قوية لتحليل الخلايا التائية شحمي…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probe | S-866 |
Riferimenti
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
