कीट कक्ष में पुनः संयोजक mCD1d प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक विधि.
Summary
एक विधि के लिए कीट कोशिकाओं को तैयार करने और उन्हें पुनः संयोजक mCD1d mCD1d tetramers पैदा proteinand के उत्पादन के उद्देश्य के लिए baculovirus साथ संक्रमित.
Abstract
CD1 प्रोटीन प्रतिजन पेश अणुओं की एक तिहाई वर्ग का गठन. वे कोशिका की सतह glycoproteins, लगभग 50 केडीए ग्लाइकोसिलेटेड भारी जंजीरों कि noncovalently beta2-microglobulin के साथ जुड़े रहे हैं के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. वे बजाय लिपिड पेप्टाइड्स बाँध. हालांकि उनकी संरचना MHC वर्ग मैं और वर्ग द्वितीय प्रतिजन अणुओं पेश CD1 प्रोटीन की समानता की पुष्टि, mCD1d नाली अपेक्षाकृत संकीर्ण, गहरी, और अत्यधिक hydrophobic है और यह दो बाध्यकारी जेब कई शास्त्रीय लिए वर्णित उथले जेब के बजाय MHC प्रतिजन – पेश अणुओं इनकोडिंग. उनके एमिनो एसिड दृश्यों के आधार पर, ऐसी hydrobphobic नाली लिपिड प्रतिजनों के बंधन के लिए एक आदर्श वातावरण प्रदान करता है.
प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाओं (NKT) उनके TCR उपयोग करने के लिए बाध्य glycolipids या CD1d द्वारा प्रस्तुत की पहचान कर सकते हैं. टी कोशिकाओं लिपिड CD1 द्वारा प्रस्तुत प्रतिक्रियाशील autoimmune और संक्रामक रोगों के खिलाफ संरक्षण में और ट्यूमर अस्वीकृति में शामिल किया गया है. इस प्रकार, की पहचान करने के लिए, शुद्ध और CD1 प्रतिक्रियाशील NKT सेल की प्रतिक्रिया को ट्रैक करने की क्षमता काफी महत्व की है. CD1d साथ अल्फा Galactosyl ceramide (एक Galcer) के tetramers पीढ़ी NKT कोशिकाओं के जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि है. अन्य CD1 अणुओं से निर्माण tetramers भी उत्पन्न किया गया है और इन नए अभिकर्मकों लिपिड प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के कार्यों का बहुत ज्ञान का विस्तार किया है लिपिड आधारित टीकों के जवाब की निगरानी में क्षमता का उपयोग के साथ और autoimmune रोगों और अन्य के निदान में, उपचार.
Protocol
Discussion
इस प्रक्रिया में, यह दिखाया गया है कैसे आरंभ करने के लिए बढ़ती है, कीट कोशिकाओं को संक्रमित और कैसे इन कोशिकाओं का उपयोग baculovirus टिटर. इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में कोशिकाओं के रखरखाव कर रहे हैं और baculovir…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probe | S-866 |
Riferimenti
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
