En metod för produktion av rekombinanta mCD1d Protein i insektsceller.

Summary

En metod för att förbereda insekt celler och infektera dem med baculovirus för att produktion av rekombinanta mCD1d proteinand generera mCD1d tetramers.

Abstract

CD1 proteiner utgör en tredje klass av antigen-presenterande molekyler. De är cellytan glykoproteiner, uttryckt i cirka 50-kDa glykosylerat tunga kedjor som noncovalently är förknippade med beta2-mikroglobulin. De binder fett snarare än peptider. Även om deras struktur bekräftar likheten mellan CD1 proteiner till MHC klass I och klass II antigenpresenterande molekyler är mCD1d spåret relativt smal, djup och mycket hydrofoba och har två bindande fickor istället för flera små fickor beskrivs för klassiska MHC- kodade antigen-presenterande molekyler. Baserat på deras aminosyra sekvenser, ger en sådan hydrobphobic spår en idealisk miljö för bindning av lipid antigener.

Det Naturliga mördar-T (NKT) celler använder sin TCR att känna igen glykolipider bundna till eller presenteras av CD1d. T-celler reaktiva med lipider presenteras av CD1 har varit inblandade i skyddet mot autoimmuna och smittsamma sjukdomar och i tumören avslag. Således är förmågan att identifiera, rena och spåra svar CD1-reaktiva NKT celler av stor betydelse. Den generationen av tetramers av alfa Galactosyl Ceramide (en-Galcer) med CD1d har betydande insikt i biologi NKT celler. Tetramers konstrueras från andra CD1 molekyler har också genererat och dessa nya reagenser har kraftigt utökad kunskap om funktioner av lipid-reaktiva T-celler, med potentiell användning i övervakningen svaret på lipid-baserat vaccin och vid diagnostisering av autoimmuna sjukdomar och andra behandlingar.

Protocol

I. Tina Celler Ta den frusna flaskan med TN5 celler, och tina den i en 37 ° C vattenbad. Tillsätt 5 ml insekt Express medium (Invitrogen, katalognummer-10.486) i 25 cm 2 TC kolv. Observera att Express fem kommer utan Glutamin, behöver lägga till 10 ml 100X glutamin penna streptokocker eller Glutamin ensam till ett LT medier. Lägg TN5 celler i det och inkubera i 30 minuter i en 27 ° C inkubator. Sedan aspirera på medellång med DMSO försiktigt utan att störa cellerna sitter p…

Discussion

I detta förfarande, visas det hur du initierar, växa, infektera insekter celler och hur titer de baculovirus använda dessa celler. De viktigaste aspekterna av detta förfarande är underhåll av celler och att veta den exakta titer av baculovirus. När du har genererat CD1 tetramers, kan de användas som ett kraftfullt verktyg för analys av glykolipiden reaktiva T-celler. Baculovirus system används också ofta för att producera rekombinanta proteiner, inklusive MHC klass II tetramers så detta förfarande har ett mycket bredare tillä…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Express Five SFM	Serum Free Medium	Invitrogen	10486025
High Five TM	Insect Cells	Invitrogen	B855-02
Glutamine Pen strep	Antibiotics	Invitrogen	10378-016
25cm2 TC Flask	Plastic	Fisher	10-126-28
175 cm2 TC Flask	Plug seal flask	Fisher	10-126-8
Erlenmeyer Flask	Cell Culture Flask	Fisher	07 200 672
YM 30 Concenterator	30,000 MWCO	Millipore	UFC 903096
FPLC equipment		GE Healthcare
BrA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Ni-NTA Agarose Column	His Tag Protein Purification Column	GE Healthcare
Desalting column	To get Rod of Salt from Protein	GE Healthcare
MonoQ Column	Anion Exchange Chromatgraphy	GE Healthcare
S200 Column	Size Exclusion Chromatography	GE Healthcare
alpha-Galcer	Glycolipid
PE- Streptavidin	For conjugating Protein	Molecular Probe	S-866