Isolation simultanée de cardiomyocytes de haute qualité, de cellules endothéliales et de fibroblastes d'un coeur de rat adulte
Summary
Plusieurs protocoles ont été développés et décrits pour l'isolement de différents types de cellules cardiaques d'un cœur de rat. Ici, un protocole optimisé est décrit qui permet d'isoler des types de cellules cardiaques majeurs de haute qualité (cardiomyocytes, cellules endothéliales et fibroblastes) à partir d'une seule préparation, réduisant ainsi les coûts expérimentaux.
Abstract
Le rat est un modèle animal important utilisé dans la recherche cardiovasculaire, et les cellules cardiaques de rat sont utilisées habituellement pour une analyse in vitro des mécanismes moléculaires de la progression de la maladie cardiovasculaire telles que l'hypertrophie cardiaque, la fibrose et l'athérosclérose. Bien que plusieurs tentatives de succès variable aient été faites pour développer des lignées cellulaires immortalisées du système cardiovasculaire pour comprendre ces mécanismes cellulaires, les cellules primaires offrent un environnement plus naturel et plus proche de l'in vivo pour de telles études. Par conséquent, différents laboratoires travaillant sur un type de cellule particulier ont développé des protocoles pour isoler les types individuels de cellules cardiaques de rat d'intérêt. Cependant, il manque un protocole qui permet l'isolement de plus d'un type de cellule. On décrit ici un protocole optimisé qui permet l'isolement de types de cellules cardiaques majeurs de haute qualité (cardiomyocytes, cellules endothéliales et fibroblastes) à partir d'une seule préparation et permet d'isolerR pour les analyses cellulaires. Cela permet l'utilisation la plus efficace des ressources disponibles, ce qui peut gagner du temps et réduire les coûts de recherche.
Introduction
Les modèles de rongeurs ont longtemps été utilisés comme outils pour élargir notre compréhension de la physiologie cardiovasculaire dans la santé et la maladie. 1 Bien que ces modèles animaux nous permettent de comprendre la pathophysiologie d'une maladie au niveau des organes et d'analyser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de divers agents pharmacologiques utilisés pour traiter les maladies cardiovasculaires, la compréhension des mécanismes moléculaires du développement de la maladie cardiovasculaire et la contribution d'un particulier Type de cellule nécessite l' utilisation de modèles de culture cellulaire in vitro . A cet effet, différentes lignées cellulaires immortalisées du système cardiovasculaire ont été développées; 2 , 3 cependant, les cellules primaires fraîchement isolées sont physiologiquement et fonctionnellement plus pertinentes pour les tissus et organismes vivants.
Le cœur est un organe polyvalent contenant tous les principaux types de cellules cardiovasculairesYstem, et le cœur du rat est encore un modèle couramment utilisé pour la compréhension de la physiologie cardiovasculaire. Au cours des dernières décennies, différentes méthodes d'isolement des types de cellules individuelles à partir du tissu cardiaque ont été décrites; 4 , 5 , 6 , 7 cependant, ces méthodes se concentrent uniquement sur l'isolement d'un type de cellule spécifique, ce qui entraîne la perte d'autres types de cellules qui ne peuvent plus être utilisées pour l'analyse cellulaire. Ici, un protocole optimisé est décrit qui permet l'isolation simultanée et de haute qualité des principaux types cellulaires de tissu cardiaque, c'est-à-dire les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes. Tous ces types de cellules peuvent être utilisés dans différentes configurations expérimentales 8 , 9 , 10 et pour l'analyse des interactions cellule-cellule du même animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, un protocole reproductible pour l'isolement et la culture des myocytes cardiaques, des cellules endothéliales et des fibroblastes est décrit. Ce protocole décrit l'isolation simultanée et de haute qualité des principaux types cellulaires de tissu cardiaque, c'est-à-dire les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes par opposition à un seul type de cellule. Une étape critique dans la procédure d'isolement est la bonne digestion du tissu cardiaque. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le soutien technique de L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas et A. Weber est reconnaissant. Les auteurs souhaitent également remercier le Dr E. Martinson pour la lecture approfondie et l'édition de la langue du manuscrit. L'étude a été soutenue par la subvention de l'Université de Giessen Anschubsfinanzierung à M. Aslam et D. Gündüz.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
Riferimenti
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