Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto
Summary
Vários protocolos foram desenvolvidos e descritos para o isolamento de diferentes tipos de células cardíacas a partir de um coração de rato. Aqui, descreve-se um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas maiores (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) de alta qualidade de uma única preparação, reduzindo os custos experimentais.
Abstract
O rato é um modelo animal importante utilizado na investigação cardiovascular e as células cardíacas de rato são utilizadas rotineiramente para a análise in vitro dos mecanismos moleculares da progressão da doença cardiovascular, tais como hipertrofia cardíaca, fibrose e aterosclerose. Embora tenham sido feitas várias tentativas com sucesso variável para desenvolver linhas celulares imortalizadas a partir do sistema cardiovascular para compreender estes mecanismos celulares, as células primárias oferecem um ambiente mais natural e próximo ao ambiente in vivo para tais estudos. Por conseguinte, diferentes laboratórios que trabalham num tipo de célula particular desenvolveram protocolos para isolar tipos individuais de células cardíacas de ratos de interesse. Um protocolo que permite o isolamento de mais de um tipo de célula, no entanto, está faltando. Aqui é descrito um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas principais de alta qualidade (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) a partir de uma única preparação e permiteR para análises celulares. Isso permite o uso mais eficiente dos recursos disponíveis, o que pode economizar tempo e reduzir os custos de pesquisa.
Introduction
Os modelos de roedores têm sido usados há muito tempo como ferramentas para ampliar nossa compreensão da fisiologia cardiovascular na saúde e na doença. 1 Embora estes modelos animais nos permitam compreender a fisiopatologia de uma doença a nível de órgãos e analisar a farmacocinética e a farmacodinâmica de vários agentes farmacológicos utilizados no tratamento de doenças cardiovasculares, a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento de doenças cardiovasculares ea contribuição de uma determinada doença Tipo celular requer o uso de modelos de cultura celular in vitro . Para este fim foram desenvolvidas diferentes linhas celulares imortalizadas do sistema cardiovascular; 2 , 3 contudo, as células primárias recentemente isoladas são fisiológica e funcionalmente mais relevantes para os tecidos e organismos vivos.
O coração é um órgão versátil que contém todos os principais tipos de células do sistema cardiovascular.Ystem, eo rato coração ainda é um modelo comumente usado para a compreensão da fisiologia cardiovascular. Durante as últimas décadas, foram descritos métodos diferentes para o isolamento de tipos de células individuais a partir de tecido cardíaco; 4 , 5 , 6 , 7 no entanto, estes métodos centram-se apenas no isolamento de um tipo de célula específico resultando na perda de outros tipos de células que não podem mais ser utilizadas para análise celular. Descreve-se aqui um protocolo otimizado que permite o isolamento simultâneo e de alta qualidade dos principais tipos celulares de tecido cardíaco, isto é, cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos. Todos estes tipos de células podem ser utilizados em diferentes configurações experimentais 8 , 9 , 10 e para a análise de interacções célula-célula a partir do mesmo animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, descreve-se um protocolo reprodutível para o isolamento e cultura de miócitos cardíacos, células endoteliais e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento simultâneo e de alta qualidade dos principais tipos celulares de tecido cardíaco, isto é , cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos em oposição a apenas um tipo de célula. Um passo crítico no procedimento de isolamento é a digestão adequada do tecido cardíaco. Se a digestão estiver incompleta, ainda pode ser obt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio técnico de L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas e A. Weber é reconhecido com gratidão. Os autores também desejam agradecer Dr. E. Martinson para extensa leitura de prova e edição de linguagem do manuscrito. O estudo foi apoiado pela Universidade de Giessen Anschubsfinanzierung concessão a M. Aslam e D. Gündüz.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
Riferimenti
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