Samtidig isolering av högkvalitativa kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster från ett vuxen råtthjärta
Summary
Flera protokoll har utvecklats och beskrivits för isolering av olika hjärtceller från ett råtthjärta. Här beskrivs ett optimerat protokoll som möjliggör isolering av högkvalitativa viktiga hjärtceller (kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster) från en enda beredning, vilket minskar försökskostnaderna.
Abstract
Råttan är en viktig djurmodell som används vid kardiovaskulär forskning, och råtta hjärtceller används rutinmässigt för in vitro- analys av de molekylära mekanismerna för kardiovaskulär sjukdomsprogression såsom hjärthypertrofi, fibros och ateroskleros. Även om flera försök med varierande framgång har gjorts för att utveckla odödliga cellinjer från hjärt-kärlsystemet för att förstå dessa cellulära mekanismer, erbjuder primära celler en mer naturlig och nära in vivo- miljö för sådana studier. Därför har olika laboratorier som arbetar med en viss celltyp utvecklat protokoll för att isolera enskilda typer av råttkardialceller av intresse. Ett protokoll som tillåter isolering av mer än en celltyp saknas emellertid. Här beskrivs ett optimerat protokoll som möjliggör isolering av högkvalitativa stora hjärtceller (kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster) från en enda beredning och möjliggör denR används för cellanalyser. Detta möjliggör den mest effektiva användningen av tillgängliga resurser, vilket kan spara tid och minska forskningskostnaderna.
Introduction
Gnagare modeller har länge använts som verktyg för att bredda vår förståelse för kardiovaskulär fysiologi inom hälsa och sjukdom. 1 Även om dessa djurmodeller tillåter oss att förstå patofysiologin hos en sjukdom på orgennivå och att analysera farmakokinetiken och farmakodynamiken hos olika farmakologiska medel som används för att behandla hjärt-kärlsjukdomar, förståelse av de molekylära mekanismerna för utveckling av kardiovaskulär sjukdom och bidraget från en särskild Celltyp kräver användning av in vitro cellodlingsmodeller. För detta ändamål har olika immortaliserade cellinjer från kardiovaskulärsystemet utvecklats; 2 , 3 är färskt isolerade primära celler emellertid fysiologiskt och funktionellt mer relevanta för levande vävnader och organismer.
Hjärtat är ett mångsidigt organ som innehåller alla större typer av celler i hjärt-kärlsjukdomarYstem och råtthjärtat är fortfarande en vanlig modell för förståelse av kardiovaskulär fysiologi. Under de senaste decennierna har olika metoder för isolering av individuella celltyper från hjärtvävnad beskrivits; 4 , 5 , 6 , 7, men dessa metoder fokuserar endast på isoleringen av en specifik celltyp som resulterar i förlusten av andra typer av celler som inte längre kan användas för cellanalys. Här beskrivs ett optimerat protokoll som möjliggör samtidig och högkvalitativ isolering av de huvudsakliga celltyperna av hjärtvävnad, dvs kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster. Alla dessa celltyper kan användas i olika experimentella inställningar 8 , 9 , 10 och för analys av cell-cell-interaktioner från samma djur.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna artikel beskrivs ett reproducerbart protokoll för isolering och kultur av hjärtmyocyter, endotelceller och fibroblaster. Detta protokoll beskriver samtidig och högkvalitativ isolering av de huvudsakliga celltyperna av hjärtvävnad, dvs kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster i motsats till bara en celltyp. Ett kritiskt steg i isoleringsförfarandet är den korrekta matsmältningen av hjärtvävnaden. Om matsmältningen är ofullständig kan ett stort antal myocyter fortfarande uppnås, men de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det tekniska stödet från L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas och A. Weber erkänns tacksamt. Författarna vill också tacka Dr. E. Martinson för omfattande bevisläsning och språkredigering av manuskriptet. Studien stöddes av Universitetet i Giessen Anschubsfinanzierung bevilja till M. Aslam och D. Gündüz.
Materials
| anti-vWF | Santa Cruz Biotech. | SC-14014 | |
| Calcium chloride | Merck | 102378 | |
| Carnitin | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | |
| Creatin | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| D-Glucose | Merck | 108342 | |
| Dil-Ac-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| EDTA Solution (0.2 M) | Biochrome AG | L2113 | |
| Embeding solution | Citiflour | AF1-25 | |
| Endothelial cell medium MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| Foetal calf serum (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isoflurane | Abbott | TU 061219 | |
| Laminin | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 medium | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 medium (Powder) | Biochrome AG | T061 | |
| Magnesium sulphate | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| NaCl solution (0.9%), Sterile | B. Braun | 30820080 | |
| Pan mouse IgG beads (Dynabeads) | Thermo Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15070-063 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Plastic consumables | Greiner Bio-One | ||
| Potassium Chloride | Merck | 4933 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 7873 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| Sodium Hydroxide Solution (2 N) | Merck | 109136 | |
| Sterile filtration system | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Water, Sterile | B. Braun |
Riferimenti
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Barbieri, S. S., Weksler, B. B. Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo. FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. (28), (2009).
- Gündüz, D., et al. Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells. Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).
- Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone. J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).
- Shahzad, T., et al. Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).
- Gündüz, D., et al. Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).
- Lipps, C., et al. N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro. J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).
- Abdallah, Y., et al. Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes. J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).
- Gündüz, D., et al. Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function. Thromb Haemost. , (2016).
- Gündüz, D., et al. Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature. J Mol.Cell Cardiol. , (2012).
