Extração e purificação de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado para o tratamento de células musculares lisas vasculares<em> In Vitro</em
Summary
Este trabalho detalha um método passo a passo para preparar extratos ricos em polifenóis de pó de baga liofilizado. Além disso, fornece uma descrição completa de como usar esses extratos ricos em polifenóis em cultura celular na presença do hormônio peptídico angiotensina II (Ang II) usando células musculares lisas vasculares (VSMCs).
Abstract
Estudos epidemiológicos indicam que o aumento da ingestão de flavonóides correlaciona-se com a diminuição da mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV) nos Estados Unidos (EUA) e na Europa. As bagas são amplamente consumidas nos EUA e têm um alto conteúdo polifenólico. Os polifenóis demonstraram interagir com muitos alvos moleculares e exercer numerosas funções biológicas positivas, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e cardioprotetores. Os polifenóis isolados do blackberry (BL), da framboesa (RB) e da framboesa preta (BRB) reduzem o estresse oxidativo e a senescência celular em resposta à angiotensina II (Ang II). Este trabalho fornece uma descrição detalhada do protocolo usado para preparar os extratos de polifenóis de bagas liofilizadas. As extracções de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado foram realizadas utilizando 80% de etanol aquoso e um método de extração assistida por ultra-som. O extracto em bruto foi ainda purificado e fraccionado utilizando clorofórmio e acetato de etilo,respectivamente. Os efeitos de extratos brutos e purificados foram testados em células musculares lisas vasculares (VSMCs) em cultura.
Introduction
Os polifenóis são compostos contendo pelo menos um anel fenólico em sua estrutura e estão abundantemente presentes no reino vegetal 1 . Os seres humanos têm consumido plantas por milênios para fins medicinais sem estar ciente da existência de tais compostos 2 . Muitas frutas e vegetais têm alguns compostos polifenólicos compartilhados, embora com diferentes quantidades, incluindo flavonóides, stilbenos e ácidos fenólicos 3 . Embora os polifenóis sejam freqüentemente associados a frutas e vegetais coloridos, isso não é estritamente verdadeiro. Por exemplo, a zeaxantina e a xantina estão presentes em vegetais que não são altamente coloridos, como cebolas e alho, que são da família de cebolas e estão associados a numerosos benefícios para a saúde 4 . Além de estar associado a vários benefícios para a saúde 5 , os polifenóis também servem as plantas, protegendo-os de insetos eD radiação ultravioleta 2 . Os polifenóis são comumente encontrados na dieta humana e são considerados poderosos antioxidantes, pois eles podem evitar as espécies reativas de oxigênio (ROS) 6 , 7 , 8 . Eles também têm propriedades antiinflamatórias 9 , antimicrobianas 10 , anti-hipertensivas 11 e antitranscinogênicas 12 , 13 .
Estudos epidemiológicos demonstram uma associação inversa entre o consumo de flavonóides e incidência de doença cardiovascular (DCV) 16 , 17 e mortalidade 14 , 15 . As bagas são amplamente consumidas nos EUA e possuem grandes quantidades de polifenóis, incluindo flavonóides. Por exemplo, o consumo de suco de amora (BL) (300 ML / d) durante oito semanas diminuiu significativamente a pressão arterial sistólica em pacientes dislipidêmicos 18 . Jeong et al. 19 relataram que homens e mulheres pré-hipertensos que consumiam 2,5 g de extrato de framboesa preta (BRB) por dia tiveram uma pressão arterial baixa de 24 horas e noite em comparação com aqueles que consumiam um placebo. As framboesas (RB) diminuíram a pressão sanguínea ao aumentar a expressão de superóxido dismutase (SOD) em ratos espontaneamente hipertensos 20 . Foi recentemente demonstrado que BL, RB e BRB reduzem os níveis de ROS e senescência induzidos pela angiotensina II (Ang II) em células musculares lisas vasculares (VSMCs) 21 . Além disso, a fração de antocianina do extracto de BL reduziu a expressão de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e inibiu a atividade do Fator Nuclear kappa B (NF-kB) e cinase regulada por sinal extracelular (ERK) em lipopolisacarídeos (LPS) estimulada Células J774Ass = "xref"> 22. Os extratos de BRB diminuíram a ativação de NF-κB e a expressão de ciclooxigenase 2 (COX-2) in vitro 23 , melhoraram o perfil lipídico e impediram a formação da lesão aterosclerose em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura 24 . As antocianinas, que são consideradas os flavonóides mais abundantes nas bagas, modulam a resposta inflamatória em macrófagos RAW 264.7 estimulados pelo LPS ao diminuir a produção 25 do Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e diminuir a proliferação e migração de VSMCs 26 .
Uma vez que tem crescido o interesse em compreender o papel dos polifenóis na saúde humana e na doença, é importante otimizar o método de extração. A extração de solvente é amplamente utilizada para esse propósito, pois é econômica e facilmente reprodutível. Neste estudo, utilizou-se uma extração solvente com etanol, juntamente com uma extração extraída por ultra-somN método, que foi adaptado de Kim e Lee 27 . A purificação e o fraccionamento de extratos brutos (CE) utilizando clorofórmio e acetato de etilo foram realizados para obter a fração de extrato purificado (PE) que foi adaptada de Queires et al 28 . Além disso, foram comparadas a eficácia de extratos de polifenóis em bruto contra purificado de BL na redução da fosforilação basal de ERK1 / 2 e foram apresentados exemplos representativos do efeito inibitório do extrato de polifenol BL purificado em reduções de sinalização induzidas por Ang II em VSMCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os polifenóis isolados das bagas contêm composições distintas. O protocolo de extração baseado em etanol descrito aqui permitiu a identificação de diferentes níveis de ácidos fenólicos e flavonóides presentes em extratos de polifenóis brutos e purificados de BL ( Tabela 1 ). CE foi enriquecido em ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquinico e ácido 5-O-cafeoilquinico. O processo de purificação não alterou significativamente os níveis de ácido gálico e ácido p-cumarico…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Associação Americana do Coração (14GRNT20180028) e pelo Conselho da Universidade Estadual da Flórida sobre Pesquisa e Criatividade (COFRS).
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
Riferimenti
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions–a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?. Crit Rev Food Sci Nutr. 56, S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
