Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari In vitro

Summary

Questo lavoro descrive un metodo passo-passo per preparare estratti ricchi di polifenoli dalla polvere di bacche congelata. Inoltre, fornisce una descrizione approfondita di come utilizzare questi estratti ricchi di polifenoli nella coltura cellulare in presenza dell'ormone peptidico angiotensino II (Ang II) utilizzando cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs).

Abstract

Gli studi epidemiologici indicano che l'aumento dell'assunzione di flavonoidi è correlato alla diminuzione della mortalità dovuta a malattie cardiovascolari (CVD) negli Stati Uniti (Stati Uniti) e in Europa. Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno un elevato contenuto polifenolico. I polifenoli hanno dimostrato di interagire con molti obiettivi molecolari e di esercitare numerose funzioni biologiche positive, inclusi gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e cardioprotettivi. I polifenoli isolati dalla mora (BL), dal lampone (RB) e dal lampone nero (BRB) riducono lo stress ossidativo e la senescenza cellulare in risposta all'angiotensina II (Ang II). Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata del protocollo utilizzato per preparare gli estratti di polifenoli da bacche congelate. Le estrazioni di polifenoli dalla polvere di bacche congelata sono state eseguite utilizzando l'etanolo acquoso al 80% ed un metodo di estrazione ad ultrasuoni. L'estratto grezzo è stato ulteriormente purificato e frazionato utilizzando cloroformio e acetato di etile,rispettivamente. Gli effetti di entrambi gli estratti grezzi e purificati sono stati testati su cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) in coltura.

Introduction

I polifenoli sono composti che contengono almeno un anello fenolico nella loro struttura e sono abbondantemente presenti nel regno vegetale ¹ . Gli esseri umani hanno consumato piante per millenni per scopi medicinali senza essere consapevoli dell'esistenza di tali composti ² . Molti frutti e verdure hanno alcuni composti polifenolici condivisi, anche se con quantità diverse, tra cui flavonoidi, stilbene e acidi fenolici ³ . Anche se i polifenoli sono spesso associati a frutta e verdura colorati, questo non è strettamente vero. Ad esempio, zeaxantina e xantina sono presenti nelle verdure che ....

Protocol

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare l'etanolo 80% (100 mL) mescolando 80 mL di etanolo assoluto (grado di biologia molecolare) e 20 mL di acqua sterile a coltura cellulare.
2. Per preparare l'estratto di polifenolo (10 mg / ml), pesare 10 mg di CE o PE. Aggiungere 1 ml di pianta Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sotto un cofano di cultura cellulare. Vortice la soluzione. Aliquota in porzioni da 200 μl e conservare a -20 ° C.
3. Preparare il buffer di lisi.
   1. Aggiungere 5 ml di soluzione 1 M di base di HEPES (pH 7,4, 50 mM finale), 1 ml di soluzione a base di 5 M NaCl (finale di 50 mM), 1 ml di 0,5 M soluzione EDTA ....

Results

È stato dimostrato in precedenza che gli estratti di polifenoli isolati da BL, RB e BRB hanno ridotto la senescenza dei VSMC in risposta a Ang II ²¹ . È stato dimostrato che questi estratti polifenolici purificati modulano la segnalazione di Ang II riducendo la fosforilazione di Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL impedisce la senescenza riducendo l'espressione della NADPH ossidasi (Nox) 1, un enzima che produce anioni superossidiche e .......

Discussion

I polifenoli isolati dalle bacche contengono composizioni distinte. Il protocollo di estrazione a base di etanolo qui descritto ha permesso di identificare diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti nei grezzi e purificati estratti polifenolici di BL ( Tabella 1 ). CE è stata arricchita in acido gallico, acido ferulico, acido 4-O-caffeoilchinico e acido 5-O-caffeoilchinico. Il processo di purificazione non alterava significativamente i livelli di acido gallico e acido p-cumarico. Tuttavia, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensina II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Trattamento di VSMCs
β-actina	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Anticorpo primario (1:5000)
Mora frutto	Mercer Foods		Mora liofilizzata in polvere
Catalasi	Calbiochem	219010	Anticorpo primario (1:1000)
Cloroformio	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Preparazione di estratti di polifenoli purificati
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM )	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Coltura di etanolo VSMC
(grado assoluto di biologia molecolare)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Preparazione di estratti di polifenoli
Acetato di etile	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Preparazione di estratti di polifenoli purificati
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Anticorpo primario (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0	Teknova, Inc.	E0306	Tampone di lisi
Liofilizzatore	Labconco	VirTis Benchtop K	Preparazione di estratti di polifenoli
Siero fetale bovino (FBS)	Seradigm	1400-500	Coltura cellulare
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Tampone di lisi
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Tampone di lisi
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01	Tampone di lisi
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Tampone di lisi
Na4P2O7 , decaidrato	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Tampone di lisi
fosfo ERK1/2	Tecnologia di segnalazione cellulare, Inc.	9101S	Cocktail di inibitori della proteasi (1:1000) anticorpi primari
	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Tampone di lisi
Reagente colorante per il dosaggio delle proteine	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006	Misurazione della concentrazione di proteine
Membrana di trasferimento PVDF	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western blots
Evaporatore rotatorio	Buchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Preparazione di estratti di polifenoli
Acqua sterile	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Preparazione di estratti di polifenoli
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Preparazione di estratti cellulari
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Anticorpo primario (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western blots
Whatman #2 carta da filtro	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Preparazione di estratti di polifenoli