Exakt cellablationsmetod för modellering av akut njurskada vid utveckling av sebrafisk
Summary
Detta arbete presenterar en ny in vivo- modell av segmentell njurskada med användning av NGF-transgena zebrafisk. Modellen möjliggör induktion av den riktade ablationen av njureepitelceller för att visa de cellulära mekanismerna för nephronskada och reparation.
Abstract
Akut njurskada (AKI) är ett vanligt sjukdomstillstånd med hög dödlighet. Med njurens reparationsförmåga är det möjligt att återställa tillräcklig njurefunktion efter stödjande behandling. En bättre förståelse för hur nephroncellsdöd och reparation sker på cellulär nivå krävs för att minimera celldöd och för att förbättra den regenerativa processen. Zebrafish pronephros är ett bra modellsystem för att uppnå detta mål eftersom det innehåller anatomiska segment som liknar däggdjursnephronen. Tidigare var den vanligaste modellen som användes för att studera njursskador i fisken den farmakologiska gentamicinmodellen. Emellertid tillåter denna modell inte exakt spatiotemporal kontroll av skada, och det är därför svårt att studera cellulära och molekylära processer som är involverade i njurreparation. För att övervinna denna begränsning presenterar detta arbete en metod, genom vilken, i motsats till gentamicin-tillvägagångssättet, ett specifikt Green Fuorescent Protein (GFP) -exempelPressande nefron-segment kan fotograferas med en violett laserljus (405 nm). Denna nya modell av AKI ger många fördelar som andra metoder för epitelskada saknar. Dess främsta fördelar är möjligheten att "ringa" nivån på skada och den exakta spatiotemporala kontrollen i den robusta in vivo djurmodellen. Denna nya metod har potential att avsevärt öka förståelsen för njurskador och reparationsmekanismer.
Introduction
Akut njurskada (AKI) 1 , 2 , som även kan benämnas akut njursvikt, definieras i stor utsträckning som en plötslig nedsättning vid njursjukdom 3 . Även om förståelsen för detta tillstånd har förbättrats anmärkningsvärt under åren har sjukligheten och dödligheten varit höga 1 , 2 . Den nuvarande behandlingen för detta tillstånd är främst stödjande, eftersom resultaten från flera kliniska prövningar av läkemedelsbehandling har varit negativa 4 , 5 . Njurarna är unika genom att den har möjlighet att reparera sig själv. Därför är stödjande terapi efter en tidig diagnos av AKI det bästa sättet att begränsa morbiditet 6 . Det är dock svårt att upptäcka AKI tidigt och dödligheten är en svindlande 50-80% för dem som behöver dialys 5. Med njurernas förmåga att reparera sig själva och bristen på behandlingsalternativ för detta tillstånd är det viktigt att utveckla metoder för att förbättra denna nephronregenereringsprocess.
Det har funnits många olika modeller som används för AKI-forskning som innehåller olika agenter av skada och djurmodeller. När det gäller medel för njurskador har aminoglykosidantibiotikum gentamicin använts som ett nefrotoxiskt medel som leder till AKI 7 , 8 . Flera grupper har emellertid funnit att gentamicinbehandling är dödlig för zebrafiskembryon 9 . Det orsakar tubulär skada som är för allvarlig för återvinning av embryon, vilket gör studien av förnyelse svår utan någon typ av ingrepp. Mammaliska modeller, som mus och råtta, anses också värdefulla, men de står inför många begränsningar under studien av AKI. Kanske är den största nackdelen med gnagare modeller svårigheten i visuaLizing njurarna av gnagare och därigenom bestämma de exakta spatiotemporala processerna som leder till epiteldöd och reparation.
Johnson et al. Har rapporterat en laserablationsbaserad teknik för att inducera akut njurskada i embryonala och larvalzebrafisk 9 . De använde pulserad laserablation för att skada njurarna efter en intramuskulär injektion med dextrankonjugat. Fluorescensen från dextran-konjugat möjliggör visualisering av skada och regenerering i tubuleepiteln 9 . Denna modell övervinner de två begränsningarna som nämnts ovan, men det tillåter inte graderade skador och är svår att utföra på stora, godtyckliga cellgrupper.
Den nya laserablationsbaserade zebrafiskmodellen av AKI som beskrivs här behandlar alla ovanstående begränsningar. Den pronephric njuren i larvalzebrafisken är ett moget, fungerande organ som innehåller segment som liknar däggdjuret nePhron, inklusive en glomerulus, proximala och distala tubuler och en uppsamlingskanal 10 . Zebrafish larver är också optiskt transparenta, vilket gör det möjligt att observera njurarna genom fluorescenstekniker. Sebrafisk är således en värdefull in vivo- modell av AKI, och den larval pronephriska njuren (5-12 dagar efter fertilisering (dpf)) kan användas för att studera cell- och molekylära processer som är involverade i njurskada och reparation.
Detta papper presenterar en metod genom vilken specifika gröna fluorescerande proteiner (GFP) -expressande nephron-segment kan fotograferas med hjälp av ett 40-nm-ljudeffektivt (jämfört med ett pulserande lasersystem) violett laserljus. GFP-fluorescensen möjliggör inriktningen av en grupp av celler, vilket gör de förändringar som uppträder synliga genom observation av GFP-fotobildning. Dessutom fungerar GFP (genom absorption av violett ljus) som en energisänkning för att förstärka skadorna i GFP-uttryckande njurceller. Time-lapse-mikroKopia kan sedan användas för att studera reparationsprocessen. Studier har funnit cellproliferation, cellmigration och cellmetaplasi 11 , 12 , 13 för alla är potentiella processer som kan spela en viktig roll vid njurreparation. Emellertid har den relativa betydelsen av dessa processer och detaljerna i deras samspel varit svåra att upptäcka på grund av begränsningarna av existerande modeller av AKI. Med hjälp av detta nya tillvägagångssätt kunde man visa att cellmigration spelar en central roll vid njurreparation efter akut skada 14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Det bör noteras att den totala laserkraften varierar mellan system. Med hjälp av procentuell GFP-fotobildning tillåter man emellertid en utläsning av den totala energin som levereras till fluorescerande njuren, oberoende av variationen i laserkraft och kompenseras för längden av exponeringen. Tänk på att svaret från olika vävnader till denna metod för fotoablation varierar. Även vid njurmognad är det betydligt svårare att få en 50% minskning av GFP-fluorescens hos yngre embryon än hos mogna larver. Dessa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi skulle vilja tacka doktor Iain Drummond och Dr. Vladimir Korzh för att dela transplantat med njure GFP. Vi vill också tacka NYITCOM för att tillhandahålla nödvändiga resurser för att utföra detta arbete. Denna studie stöddes delvis av bidrag: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) och HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Petri Dishes, 35 x 10mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4,2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
