Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Summary

Este trabalho apresenta um novo modelo in vivo de lesão renal segmentar usando peixe zebra transgênico GFP renal. O modelo permite a indução da ablação direcionada de células epiteliais renais para mostrar os mecanismos celulares de lesão e reparação de néphron.

Abstract

Lesão renal aguda (LRA) é uma condição médica comum com alta taxa de mortalidade. Com as habilidades de reparo do rim, é possível restaurar a função renal adequada após o tratamento de suporte. No entanto, é necessária uma melhor compreensão de como ocorre morte e reparação de células nefronas no nível celular para minimizar a morte celular e melhorar o processo regenerativo. O pronephros do peixe-zebra é um bom sistema modelo para atingir esse objetivo, pois contém segmentos anatômicos que são semelhantes à nefrona dos mamíferos. Anteriormente, o modelo mais comum usado para estudar lesão renal em peixes era o modelo farmacológico de gentamicina. No entanto, este modelo não permite um controle espaciotemporal preciso da lesão e, portanto, é difícil estudar os processos celulares e moleculares envolvidos no reparo renal. Para superar esta limitação, este trabalho apresenta um método através do qual, em contraste com a abordagem gentamicina, uma Proteína Fuorescente Verde específica (GFP) -exPressionar o segmento nephron pode ser fotoablado usando uma luz laser violeta (405 nm). Este novo modelo de AKI oferece muitas vantagens que outros métodos de lesão epitelial não possuem. Suas principais vantagens são a capacidade de "marcar" o nível de lesão e o controle espaciotemporal preciso no modelo robusto animal in vivo . Este novo método tem potencial para avançar significativamente o nível de compreensão dos mecanismos de lesão renal e reparação.

Introduction

Lesão renal aguda (LRA) ^{1 , 2} , que também pode ser referida como insuficiência renal aguda, é amplamente definida como uma deficiência súbita na função renal ³ . Embora o nível de compreensão desta condição tenha sido melhorado notavelmente ao longo dos anos, as taxas de morbidade e mortalidade permaneceram altas ^{1 , 2} . O tratamento atual para esta condição é principalmente solidário, já que os resultados de vários ensaios clínicos de terapia medicamentosa foram negativos ^{4 , 5} . O rim é único, pois tem a capacidade de se reparar. Portanto, a terapia de suporte após um diagnóstico precoce da IRA é a melhor maneira de limitar a morbidade ⁶ . No entanto, é difícil detectar a IRA precoce e a taxa de mortalidade é um escalonamento de 50-80% para aqueles que necessitam de diálise ⁵. Com a capacidade dos rins para reparar e a falta de opções de tratamento para esta condição, é importante desenvolver métodos para melhorar este processo de regeneração de néphron.

Houve muitos modelos diferentes utilizados para pesquisa de AKI que inclui diferentes agentes de lesões e modelos de animais. Em termos de agentes de danos nos rins, o antibiótico gentamicina aminoglicosídeo tem sido utilizado como agente nefrotóxico que leva a AKI ^{7 , 8} . No entanto, vários grupos descobriram que o tratamento com gentamicina é letal para o embrião de peixe-zebra ⁹ . Causa dano tubular muito grave para a recuperação do embrião, dificultando o estudo da regeneração sem algum tipo de intervenção. Os modelos de mamíferos, como o rato e o rato, também são considerados valiosos, mas enfrentam muitas limitações durante o estudo da IRA. Talvez a principal desvantagem dos modelos de roedores seja a dificuldade em visuaLizing o rim dos roedores e, assim, determinando os processos espaciotemporais precisos que levam à morte epitelial e ao reparo.

Johnson et al. Relataram uma técnica baseada em ablação a laser para induzir lesão renal aguda em peixe zebra embrionário e larval ⁹ . Eles usaram ablação a laser pulsada para danificar o rim após uma injeção intramuscular com conjugados de dextrano. A fluorescência dos conjugados de dextrano permite a visualização de dano e regeneração no epitélio tubular ⁹ . Este modelo supera as duas limitações mencionadas acima, mas não permite níveis graduados de lesão e é difícil de realizar em grandes grupos de células arbitrárias.

O novo modelo de AKI, descrito em ablação a laser, descrito aqui aborda todas as limitações acima. O rim pronefrico no peixe zebra larval é um órgão maduro e funcional que contém segmentos similares à nebulosa de mamíferoPhron, incluindo um glomérulo, túbulos proximais e distal, e um ducto colector ¹⁰ . As larvas de zebrafish também são opticamente transparentes, tornando possível observar o rim através de técnicas de fluorescência. Assim, o peixe-zebra é um valioso modelo in vivo de IRA, e o rim pronefrico larval (5-12 dias após a fertilização (dpf)) pode ser usado para estudar os processos celulares e moleculares envolvidos em lesão renal e reparação.

Este artigo apresenta um método através do qual os segmentos de Nephron específicos de proteína fluorescente verde (GFP) podem ser fotoablados usando uma luz laser violeta de baixa energia (em comparação com um sistema de laser pulsado) (405 nm). A fluorescência GFP permite a segmentação de um grupo de células, tornando as mudanças que se tornam visíveis através da observação do fotobloco GFP. Além disso, o GFP (absorvendo a luz violeta) serve como um coletor de energia para potencializar a lesão em células renais que expressam GFP. Microfones de lapso de tempoA cópia pode então ser usada para estudar o processo de reparo. Estudos têm encontrado proliferação celular, migração celular e metaplasia celular ^{11 , 12 , 13} para todos ser processos potenciais que podem desempenhar um papel importante na reparação renal. No entanto, a importância relativa desses processos e os detalhes de sua interação foram difíceis de descobrir devido às limitações dos modelos existentes de AKI. Usando essa abordagem inovadora, foi possível mostrar que a migração celular desempenha um papel central no reparo renal após lesão aguda ¹⁴ .

Protocol

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade de NYIT College of Osteopathic Medicine (NYITCOM IACUC). Toda a cirurgia e experimentação in vivo foi realizada sob anestesia tricaína, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. 1. Obtendo e mantendo embriões <o…

Representative Results

Observe que este protocolo foi usado com sucesso com várias linhas transgênicas de GFP renal, incluindo ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 e Tg (atp1a1a.4: GFP). Os exemplos de resultados apresentados aqui foram obtidos usando a linha ET (krt8: EGFP) sqet11-9. A Figura 1 mostra o exemplo de protocolo de fotoablação. A intensidade média de GFP é monitorada dentro da região …

Discussion

Deve-se notar que a potência total do laser varia entre os sistemas. No entanto, o uso de porcentagem de fotoblocos GFP permite uma leitura da energia total entregue ao rim fluorescente, independente da variação na potência do laser e compensada pelo período de exposição. Tenha em mente, no entanto, que a resposta de diferentes tecidos a este método de fotoablação varia. Mesmo durante a maturação do rim, é significativamente mais difícil obter uma redução de 50% na fluorescência de GFP em embriões mais…

Materials

Petri Dishes, 35 x 10mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4,2.7
Petri Dishes, 100 x 15mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2