Vi beskriver en teknikk for anvendelse av muse embryonale stamceller for generering av to eller tredimensjonale embryoidlegemene. Vi forklarer hvordan å indusere differensiering av nevrale embryoid kroppscellene hos retinsyre, og hvordan å analysere deres tilstand av differensiering av stamceller markør immunfluorescens og immunblotting.
Muse embryonale stamceller (ESCS) er isolert fra den indre massen av blastocysten (typisk dag E3.5), kan bli anvendt som in vitro modellsystem for å studere tidlige embryoutvikling. I fravær av leukemi-inhiberende faktor (LIF), ESCs differensiere som standard i neurale forløperceller. De kan bli samlet inn i en tre-dimensjonal (3D) sfærisk aggregat betegnet embryoid legeme (EB) på grunn av dets likhet til tidlig stadium embryo. EBS kan podes på fibronectin-belagte dekkglass, hvor de utvider seg ved økende todimensjonale (2D) utvidelser eller implantert i 3D kollagenmatrikser hvor de fortsetter å vokse som sfæroider, og skille ut de tre kimlag: endodermal, mesodermal, og ectodermal. 3D-kollagen kulturen etterligner in vivo miljøet tettere enn 2D EBS. 2D EB kultur muliggjør analyse av immunfluorescens og immunblotting for å spore differensiering. Vi har utviklet en to-trinns nevrale differentiasjon protokoll. I det første trinn blir EBS generert av den hengende dråpe-teknikk, og, samtidig, blir indusert til å differensiere ved hjelp av eksponering for retinsyre (RA). I det andre trinnet, neural differensiering forløper i et 2D eller 3D-format i fravær av RA.
ESCs stammer fra blastocyst indre cellemasse. Disse cellene er pluripotent, dvs. de har kapasitet til å differensiere i en celle type organisme opprinnelsesland. ESC in vitro differensiering er av bred interesse som et eksperimentelt system for å undersøke utviklingsveier og mekanismer. Det har en kraftig og fleksibel modellsystem for å teste nye terapeutiske tilnærminger for korrigering av celle og vev dysfunksjon. EBS rekapitulere mange aspekter av celledifferensiering i tidlig embryogenese. Spesielt kan EBS brukes når embryoniske letalitet gjør det vanskelig å bestemme den cellulære basis av de embryoniske defekter 1, 2. EBS kan dannes enten ved den hengende dråpe eller flytende suspensjonsteknikker 3. Fordelen med det tidligere er evnen til å generere EBS med jevn størrelse og tetthet og letter således eksperimentelle reproduserbarhet.
<p class = "jove_content"> Interaksjon med ekstracellulære matriks (ECM) adhesjonsproteiner kan påvirke motilitet og overlevelse av adherente celler. I det 2D-kultursystemet, er fibronektin ofte brukt for å øke celle adhesjon til substratet. Fibronektin er et basal lamina komponent som gjenkjennes av 10 typer av celleoverflate-integrin-heterodimerer 4.RA er en liten lipofilt metabolitt av vitamin A som induserer differensiering neural 5, 6. Høye konsentrasjoner av RA fremme nerve genekspresjon og undertrykker mesodermal genekspresjon i løpet av EB formasjon 7, 8. RA er produsert av vitamin A-oksydasjon til retinaldehyde ved enten alkohol eller retinol-dehydrogenase, etterfulgt av retinaldehyde oksydasjon til det endelige produkt ved retinaldehyde dehydrogenase 9. Neural differensiering krever transport av RA fra cytoplasma til kjernen ved cellulære RA-bindende protein 2 (CRABP2). I kjernen, RA bindes til sin tilhørende reseptor-komplekset som består av en RAR-RXR heterodimer 10. Dette resulterer i rekruttering av transkripsjonelle ko-aktivatorer, og initiering av transkripsjon 9, 11. Videre fremmer RA nedbrytningen av fosforylert (aktiv) Smad 1, således antagonisering BMP og SMAD signale 12. I tillegg til disse aktiviteter øker RA Pax6 uttrykk, en transkripsjonsfaktor som støtter nevrale differensiering 13. RA signale moduleres av Sirtuin-1 (SIRT1), en kjernefysisk nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD +) – avhengig enzym som deacetylates CRABP2, interferere med dens translokasjon til kjernen, og følgelig med RA-binding til RAR-RXR heterodimer 14, 15, 16.
e_content "> Vårt mål i utformingen av RA-behandlede EB protokollen som er beskrevet her er for å optimalisere neural differensiering for å lette in vitro-analyse av de signalveier som regulerer ESC differensiering til neuronale forløperceller. En av fordelene ved denne protokollen er tilrettelegging av analyse av cellefunksjon ved immunfluorescens. 3D EBS ikke er godt gjennomtrengt av antistoffer og er vanskelige å bilde. EB dissosiering i et 2D-monolaget på bestemte tidspunkter i løpet av neural differensiering letter immunmerking og avbildning av cellene ved hjelp av konfokal mikroskopi.I denne protokollen presenterer vi en forholdsvis enkel og tilgjengelig metode for å studere nevrale differensiering av murine ESCs. I tidligere protokoller, ble RA tilsatt til mediet på dag 2 og dag 4 av den EB hengende dråpe 8 eller ved suspensjonskultur 7, henholdsvis, eller umiddelbart etter EB hengende dråpe aggregering 21. I protokollen vi utviklet, ble RA lagt tidligere. Til tross for den tidligere innføring av RA til EBS dannet av suspe…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av NIH stipend R01 HL119984 til AH
Materials | |||
MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
Dark 1.5 ml centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
Cell strainer | Corning | 352360 | |
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
PBS | Gibco | 10010049 | |
Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |