LERLIC-MS / MS per approfondita caratterizzazione e quantificazione di glutammina e asparagina deamidazione in Fucile Proteomics
Summary
Qui vi presentiamo un protocollo passo-passo del lungo lunghezza elettrostatico repulsione-idrofilo interazione cromatografia-spettrometria di massa tandem metodo (LERLIC-MS / MS). Questa è una nuova metodologia che consente per la prima volta quantificazione e caratterizzazione dei glutammina e asparagina isoforme deamidazione da proteomica fucile.
Abstract
Caratterizzazione di deamidation proteina è indispensabile per decifrare il ruolo (s) e le potenzialità di questa proteina post-traslazionale modifica (PTM) nella patologia umana e in altri contesti biochimici. Al fine di eseguire la caratterizzazione di deamidation proteine, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo lungo lunghezza elettrostatico interazione cromatografia-spettrometria di massa tandem repulsione-idrofilo (LERLIC-MS / MS) Metodo che può separare la glutammina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) prodotti di deamidation da composti modello a campioni biologici molto complessi. LERLIC-MS / MS è, dunque, la prima strategia proteomica fucile per la separazione e la quantificazione di Gln isoforme deammidazione. Abbiamo anche dimostrato, come una novità, che il protocollo di trasformazione campione qui delineato stabilizza l'intermedio succinimmide permettendo la sua caratterizzazione LERLIC-MS / MS. L'applicazione di LERLIC-MS / MS come mostrato in questo articolo il video può aiutare a chiarire il momento sconosciutoarray n molecolari deamidation proteine. Inoltre, LERLIC-MS / MS fornisce ulteriore comprensione delle reazioni enzimatiche che comprendono deamidation in sfondi biologiche distinte.
Introduction
Deamidation è una modificazione post-traduzionale di proteine (PTM) che introduce una carica negativa al backbone proteina mediante una modifica di asparagina (Asn) e / o glutammina (Gln) residui 1. Questa modifica mentre colpisce residui Asn genera prodotti isomerici acido isoaspartic (isoAsp) e n acido -aspartic (Asp) ad un comune rapporto 3: 1 2. Nonostante, questo rapporto può essere alterato dall'intervento della riparazione enzima L-isoaspartyl metiltransferasi (PIMT) 3, 4. Analogamente, deamidation di residui Gln genera acido isomerica gamma-glutammico (γ-Glu) e isoforme di acido alfa-glutammico (α-Glu) ad un atteso rapporto 1: 3, 5 7, ma questo rapporto può essere spostata dall'azione di l'onnipresente enzima transglutaminasi 2 e altri transglutaminasi, compreso transglutaminasi 1, una enzyme recentemente identificato come associati con vescicole extracellulari nel cervello 6.
L'origine di deamidation può essere spontanea o enzimatica, il primo è particolarmente comune sui residui Gln in cui transglutaminasi e altri enzimi mediano reticolante / intra-molecolare tra via transamidazione (vedere 3 per ulteriori dettagli sulla Gln transammidazione e sue implicazioni in diversi cronica e malattie umane fatali). Pertanto, deamidation è un PTM che si ripercuote determinante sulla struttura e funzione delle molecole interessate 4, 7, 8 e richiede una caratterizzazione chimico approfondita 3 alla luce delle sue diverse conseguenze biochimiche compreso il servizio di clock molecolare dell'invecchiamento 9 .
Anche se deamidation dei residui Asn è stata relativamente ben caratterizzato dal basso verso l'alto fucile proteomica 1, 10, deammidazione di residui Gln ancora non ha un metodo di caratterizzazione adatto oltre l'analisi impegnativo composti modello da elettron-based frammentazione radicale 11. Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo unidimensionale proteomica fucile strategia (LERLIC-MS / MS) 3 che consente la separazione di Gln e Asn isoforme deamidazione da campioni biologici complessi e composti modello in una singola analisi. LERLIC-MS / MS è basato sulla separazione dei triptica digerito peptidi utilizzando una lunga lunghezza (50 cm) colonna di scambio ionico (LAX) operando in modalità elettrostatica repulsione-idrofila cromatografia a interazione (Erlic) ed accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC MS / MS). Questa nuova strategia analitico è stato usato per caratterizzare e quantificare relativamente l'estensione di ciascuna residuo deamidato nei tessuti cerebrali umanif "> 3. Tuttavia, il protocollo descritto qui fornirà immagini video di LERLIC-MS / MS mirava a studiare le peculiarità di deamidation proteine nel contesto biochimica di interesse.
ETICA DICHIARAZIONE
Tutte le procedure di questo protocollo sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale della Nanyang Technological University di Singapore e sono state eseguite in conformità alle linee guida istituzionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo video-articolo presentiamo un protocollo passo-passo di LERLIC-MS / MS 3, un metodo per eseguire la caratterizzazione approfondita e di determinare con precisione l'entità del deammidazione proteine ei processi enzimatici coinvolti in questa modifica proteina. LERLIC-MS / MS è basato sull'uso di un lungo lunghezza (50 cm) LAX secondo il principio della elettrostatico cromatografia interazione repulsione-idrofila (Erlic) 27. L'utilizzo di una colonna…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato in parte sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (Tier 2: Grant ARC9 / 15), Consiglio Nazionale delle Ricerche di Medicina di Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016), e NTU-NHG Aging Research Grant ( concessione ARG / 14017). Vorremmo esprimere la nostra gratitudine e il più sincero ringraziamento al Dr. Andrew Alpert e la squadra PolyLC per ci ha gentilmente fornito il materiale di imballaggio che hanno reso possibile questo studio.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
Riferimenti
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