LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics
Summary
Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la spectrométrie de masse de grande longueur d'interaction de répulsion électrostatique chromatographie hydrophile-tandem procédé (LERLIC-MS / MS). Ceci est une nouvelle méthodologie qui permet pour la première quantification et la caractérisation des temps glutamine et l'asparagine isoformes désamidation par protéomiques de fusil de chasse.
Abstract
Caractérisation des désamidation des protéines est impératif de déchiffrer le rôle (s) et les potentialités de cette modification post-traductionnelle de protéines (PTM) en pathologie humaine et d'autres contextes biochimiques. Afin d'effectuer la caractérisation des protéines désamidation, nous avons récemment développé une nouvelle spectrométrie de masse de grande longueur d'interaction répulsion hydrophile électrostatique chromatographie en tandem méthode (LERLIC-MS / MS) qui peut séparer la glutamine (Gln) et isoforme asparagine (Asn) produits de désamidation de composés modèles à des échantillons biologiques complexes. LERLIC-MS / MS est, par conséquent, la première stratégie protéomiques de fusil de chasse pour la séparation et la quantification des isoformes de Gln désamidation. Nous démontrons aussi, comme une nouveauté, que le protocole de traitement de l'échantillon décrit ici stabilise l'intermédiaire permettant sa caractérisation succinimide par LERLIC-MS / MS. Application de LERLIC-MS / MS comme indiqué dans cet article vidéo peut aider à élucider le moment Unknown matrices moléculaires de désamidation des protéines. De plus, LERLIC-MS / MS fournit une meilleure compréhension des réactions enzymatiques qui englobent désamidation dans les milieux biologiques distincts.
Introduction
Désamidation est une modification post – traductionnelle des protéines (PTM) qui introduit une charge négative sur le squelette de la protéine par modification de l' asparagine (Asn) et / ou de la glutamine (Gln) les résidus 1. Cette modification tout en affectant des résidus Asn génère les produits isomères d' acide isoaspartique (isoAsp) et l' acide aspartique (Asp) à un 3 commun: rapport 1 2. Néanmoins, ce rapport peut être modifié par l'intervention de l'enzyme de réparation L-isoaspartyl méthyltransférase (PIMT) 3, 4. De même, la désamidation de résidus Gln génère l'acide gamma-glutamique isomérique (γ-Glu) et des isoformes de l' acide alpha-glutamique (α-Glu) à une escompté 1: 7 Ratio 3, 5, mais ce rapport peut être déplacé par l'action de l'enzyme ubiquitaire transglutaminase 2 et d'autres transglutaminases, y compris transglutaminase 1, enzyme récemment identifié comme étant associées à des vésicules extracellulaire dans le cerveau 6.
L'origine de la désamidation peut être soit spontanée ou enzymatique, le premier est particulièrement fréquent sur les résidus Gln dans lequel transglutaminases et d' autres enzymes médient reticulation inter / intra-moléculaire par transamidation (voir 3 pour plus de détails sur Gln transamidation et ses implications dans plusieurs chroniques et maladies humaines fatale). Par conséquent, la désamidation est un PTM qui a une répercussion décisive sur la structure et la fonction des molécules concernées 4, 7, 8 et nécessite une caractérisation chimique en profondeur 3 à la lumière de ses conséquences biochimiques différentes , y compris son service comme horloge moléculaire du vieillissement 9 .
Bien que désamidation des résidus Asn a été relativement bien caractérisé par la protéomique fusil de chasse de bas en haut 1, 10, désamidation de résidus Gln n'a toujours pas une méthode de caractérisation approprié au – delà de l'analyse difficile de composés modèles par fragmentation radical électron-11. Nous avons récemment mis au point une nouvelle stratégie de protéomique de fusil de chasse d' une dimension (LERLIC-MS / MS) 3 qui permet la séparation des isoformes et Gln Asn désamidation à partir d' échantillons biologiques complexes et composés modèles en une seule analyse. LERLIC-MS / MS sont basées sur la séparation des peptides digérés à la trypsine en utilisant une grande longueur (50 cm) sur une colonne échangeuse d'ions (LAX) fonctionnant en mode de chromatographie d'interaction de répulsion hydrophile électrostatique (Erlic) et couplée à spectrométrie de masse tandem (LC- MS / MS). Cette nouvelle stratégie d'analyse a été utilisée pour caractériser et relativement quantifier l'étendue de chaque résidu désamidée dans les tissus du cerveau humainf "> 3. Néanmoins, le protocole décrit ici fournira l' imagerie vidéo de LERLIC-MS / MS visant à étudier les particularités de désamidation des protéines dans le contexte biochimique d'intérêt.
DÉCLARATION ÉTHIQUE
Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université technologique de Nanyang à Singapour et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette vidéo-article , nous présentons un protocole étape par étape de LERLIC-MS / MS 3, un procédé pour effectuer une caractérisation en profondeur et de déterminer avec précision l'étendue de la désamidation de la protéine et des procédés enzymatiques impliquées sur cette modification de la protéine. LERLIC-MS / MS est basée sur l'utilisation d'une longue longueur (50 cm) LAX selon le principe de chromatographie d'interaction de répulsion électrostatique h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été en partie financé par des subventions du ministère singapourien de l'éducation (Niveau 2: Grant ARC9 / 15), Conseil national de recherches médicales de Singapour (NMRC-DE-IRG-0003-2016) et NTU-LPN vieillissement Subvention de recherche ( Grant ARG / 14017). Nous tenons à exprimer notre gratitude et ses remerciements les plus sincères au Dr Andrew Alpert et de l'équipe PolyLC pour nous a gentiment fourni les matériaux d'emballage qui ont rendu possible cette étude.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
Riferimenti
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