LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun
Summary
כאן אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול של דחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית באורך ארוך אינטראקציה-טנדם כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (LERLIC-MS / MS) שיטה. זוהי שיטה חדשנית המאפשרת כימות לראשונה ואפיון של isoforms deamidation גלוטמין ו asparagine ידי פרוטאומיקה רובה.
Abstract
אפיון של חלבון deamidation הוא הכרחי כדי לפענח את התפקיד (ים) ועל פוטנציאל של שינוי posttranslational חלבון זה (PTM) בפתולוגיה האנושית בהקשרים ביוכימיים אחרים. על מנת לבצע אפיון של חלבון deamidation, אנו לאחרונה פיתחו ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם אינטראקציה ודחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית לטווח אורך הרומן (LERLIC-MS / MS) שיטה שיכולה להפריד בין גלוטמין (GLN) ו asparagine (ASN) איזופורם מוצרים של deamidation מן תרכובות מודל דגימות ביולוגיות מורכבות מאוד. LERLIC-MS / MS היא, אפוא, אסטרטגית פרוטאומיקה הרובה הראשונה להפרדה וכימות של isoforms deamidation GLN. אנחנו גם להפגין, כחידוש, כי פרוטוקול עיבוד מדגם המתוארות כאן מייצב את ביניים succinimide המאפשר אפיון שלה על ידי LERLIC-MS / MS. יישום של LERLIC-MS / MS כפי שמוצג במאמר זה וידאו יכול לעזור כדי להבהיר את כרגע unknowמערכים מולקולריים n של deamidation חלבון. בנוסף, LERLIC-MS / MS מספקת הבנה נוספת של תגובות אנזימטיות כי להקיף deamidation ב רקע ביולוגי מובהק.
Introduction
Deamidation הוא שינוי posttranslational חלבון (PTM) המציג מטען שלילי לשדרת חלבון באמצעות שינוי של asparagine (ASN) ו / או גלוטמין (GLN) שאריות 1. שינוי זה תוך העמדת פנים שהם שאריות ASN מייצר חומצת isoaspartic מוצרים isomeric (isoAsp) ו- n חומצה -aspartic (ASP) בבית 3 המשותף: יחס 1 2. עם זאת, יחס זה ניתן לשינוי על ידי התערבות של methyltransferase L-isoaspartyl אנזים תיקון (PIMT) 3, 4. באופן דומה, deamidation של שאריות GLN מייצר חומצת isomeric גלוטמית-גמא (γ-Glu) ו isoforms חומצה גלוטמית-אלפא (α-Glu) במכירה צפוי 1: 7 יחס 3, 5, אך יחס זה יכול להיות מוזז על ידי פעולה של transglutaminase האנזים נמצא בכל מקום 2 ו transglutaminases אחר, כולל transglutaminase 1, דוארnzyme זיהה לאחרונה הקשורים שלפוחית תאית במוח 6.
מקורו של deamidation יכול להיות ספונטני או אנזימטי, לשעבר נפוץ במיוחד על שאריות GLN שבו transglutaminases ואנזימים אחרים לתווך בין / crosslinking תוך המולקולרי באמצעות transamidation (ראה 3 לפרטים נוספים על GLN transamidation וההשלכות בכמה כרוני מחל אנושיות קטלניות). לכן, deamidation הוא PTM שיש לו השלכה מכרעת על המבנה ותפקוד של מולקולות מושפעות 4, 7, 8 ו דורש אפיון כימי מעמיק 3 לאור השלכות ביוכימיים המגוונים שלה כולל השירות שלה כמו שעון מולקולרי של הזדקנות 9 .
למרות deamidation של שאריות ASN כבר יחסית היטב מאופיין פרוטאומיקה רובה מלמטה למעלה 1, 10, deamidation של שאריות GLN עדיין אין שיטה לאפיון מתאימה מעבר לניתוח המאתגר של תרכובות מודל ידי קיטוע רדיקלי מבוסס אלקטרונים 11. פיתחנו לאחרונה אסטרטגיית פרוטאומיקה רובה אחד-מימד רומן (LERLIC-MS / MS) 3 המאפשרת הפרדה של isoforms deamidation GLN ו ASN מ דגימות ביולוגיות מורכבות תרכובות המודל בניתוח יחיד. LERLIC-MS / MS מבוסס על הפרדת פפטידים מתעכל tryptic באמצעות אורך-ארוך (50 ס"מ) טור חילוף יונים (LAX) עובד על כרומטוגרפיה אינטראקציה ודחייה-הידרופיליות אלקטרוסטטית (ERLIC) מצב מצמידים ספקטרומטריית מסה טנדם (LC- MS / MS). אסטרטגיה אנליטית חדשה זו שימשה לאפיין יחסית לכמת את מידת כל שאריות deamidated ברקמות המוח האנושיf "> 3. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן יספק הדמיה וידאו של LERLIC-MS / MS נסיון לבדוק את הייחוד של חלבון deamidation בהקשר ביוכימיים של עניין.
אמירה אתית
כל הנהלים של פרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של האוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג בסינגפור בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
In-מאמר בסרטון הזה אנחנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של LERLIC-MS / MS 3, שיטה לבצע אפיון מעמיק כדי לקבוע את המידה במדויק deamidation חלבון לבין תהליכים אנזימטיים מעורבים על שינוי חלבון זה. LERLIC-MS / MS מבוסס על השימוש באורך-ארוך (50 ס"מ) LAX תחת העיקרון של כרומטוגרפיה אינט?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו באופן חלקי בסיוע מענקים ממשרד סינגפור החינוך (Tier 2: גרנט ARC9 / 15), לאומי המועצה למחקר רפואי של סינגפור (NMRC-OF-IRG-0003-2016), ו NTU-NHG הזדקנות מחקר גרנט ( גרנט ARG / 14,017). ברצוננו להביע את תודתנו ותודה הכנה ביותר ד"ר אנדרו אלפרט וצוות PolyLC עבור ספק לנו בחביבות עם חומרי האריזה מתאפשרים במחקר זה.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
Riferimenti
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
- Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
- Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
- Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27 (2016).
- Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
- Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
- Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
- Li, X., Lin, C., O’Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
- Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
- Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
- Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106 (2016).
- Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005 (2016).
- Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
- Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
- Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)–a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
- Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
- Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20 (2016).
- Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
- Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
- Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
- Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798 (2016).
- Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
- Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111 (2011).
- Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
- Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).
