산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드
Summary
여기서 우리는 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS)에있어서의 단계적인 프로토콜을 제시한다. 이 산탄 총 단백질 체학에 의한 글루타민과 아스파라긴 탈 아미드 화 이소 형의 첫 번째 시간 정량화 및 특성화를 위해 할 수있는 새로운 방법입니다.
Abstract
단백질 탈 아미드 화의 특성은 인간의 병리 및 기타 생화학 적 맥락에서이 단백질 번역 후 변형 (PTM)의 역할 (들) 및 잠재력을 해독하는 것이 필수적이다. 단백질 탈 아미드의 특성화를 수행하기 위해, 최근 글루타민 (Gln의) 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 이성체를 분리 할 수있는 신규 한 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS) 법을 개발 매우 복잡한 생물학적 샘플 모델 화합물의 탈 아미드 화의 제품. LERLIC-MS / MS 따라서,이다, Gln의의 탈 아미드 화의 동위 효소의 분리 및 정량에 대한 첫 번째 샷건 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리는 또한 여기에 설명 된 샘플 처리 프로토콜은 LERLIC-MS / MS에 의해 그 특성을 허용 숙신이 미드 중간을 안정화 것을, 참신로 보여줍니다. 이 비디오 문서에서와 같이 LERLIC-MS / MS의 응용 프로그램은 현재 알 수없는 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다단백질 탈 아미드 화의 N 분자 배열. 또한 LERLIC-MS / MS는 별개의 생물학적 배경에서 탈 아미드를 포함 효소 반응의 추가적인 이해를 제공한다.
Introduction
탈 아미드는 단백질의 번역 후 변형 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 및 / 또는 글루타민 (Gln의) 잔류 물 (1)의 변형을 통해 단백질 골격에 음전하를 도입 (PTM)이다. 2 : 1의 비율에서 Asn 잔기에 영향을 미치는 변형하면서 공통 3에서 이성질체 제품 isoaspartic 산 (isoAsp) 및 N -aspartic 산 (ASP)를 생성한다. 그럼에도 불구하고,이 비율은 수리 효소 메틸화 된 L-isoaspartyl (PIMT) (3), (4)의 조작에 의해 변경 될 수있다. 마찬가지로, Gln의 잔기의 탈 아미드 화는 기대 (1)의 이성체 감마 글루탐산 (γ-Glu가) 및 알파 글루탐산 아형 (α-가 Glu)를 생성한다 : 7 비율 3,5-을하지만,이 비율의 작용에 의해 이동 될 수있다 유비쿼터스 효소 트랜스 글 루타 미나 제 (2)와 다른 transglutaminases, 트랜스 글 루타 미나 제를 포함 하나, 전자뇌 6 세포 외 소포와 관련된으로 nzyme 최근 확인했다.
탈 아미드의 원점 (여러 만성 더욱 Gln의의 transamidation의 내용과 그 의미 3 참조 전자는 transglutaminases 다른 효소 transamidation 통해 인터 / 분자 내 가교 결합을 매개하는 Gln의 잔기에 특히 일반적이고, 자발적 또는 효소 중 하나 일 수 있고 치명적인 인간의 질병). 따라서, 탈 아미드가 영향 분자 4, 7, 8의 중요한 구조에 파급 및 기능을 갖고, 9 노화의 서비스를 분자 시계 등의 다양한 생화학 적 결과에 비추어 심층 화학적 특성 (3)을 필요로하는 PTM은 .
의 ASN 잔류의 탈 아미드 화는되어 있지만 비교적 상향식 샷건 프로테오믹스가 잘 특성화 1, 10, Gln의 잔기의 탈 아미드 여전히 전자 계 라디칼 분열 (11)에 의한 모델 화합물의 도전 분석 이후 적절한 특성화 방법이 없다. 최근 하나의 분석에서 복잡한 생물학적 샘플과 모델 화합물로부터 탈 아미드가 Asn 및 Gln의 이성체의 분리를 가능하게하는 신규 한 측정 샷건 프로테오믹스 전략 (LERLIC-MS / MS) (3)을 개발 하였다. LERLIC-MS / MS는 긴 길이 (50cm) 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (ERLIC) 모드에서 작동 이온 교환 컬럼 (LAX)를 사용 트립신 분해 펩티드의 분리에 기초하여 탠덤 질량 분석법에 결합된다 (LC- MS / MS). 이 새로운 분석 전략의 특성과 상대적으로 인간의 뇌 조직에서 각 탈 아미드 잔류의 정도를 정량하는 데 사용되었습니다F "> 3. 그럼에도 불구하고, 여기에 설명 된 프로토콜은 관심의 생화학 적 맥락에서 단백질 탈 아미드 화의 특수성을 연구하는 것을 목표로 LERLIC-MS / MS의 비디오 영상을 제공 할 것입니다.
윤리 선언문
이 프로토콜의 모든 절차는 싱가포르의 난양 기술 대학의 제도적 검토위원회에 의해 승인되었습니다 및 제도적 지침에 따라 수행되고있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 비디오 – 문서에서 우리는 LERLIC-MS / MS (3)의 단계별 프로토콜을 제시하는 방법은 심층 특성화를 수행하고 정확하게 단백질의 탈 아미드 화,이 단백질 변형에 관여하는 효소 처리의 정도를 결정한다. LERLIC-MS / MS는 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (ERLIC) (27)의 원리 하에서 긴 길이 (50cm) LAX의 사용에 기초한다. 연구 3에 도?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
싱가포르 (NMRC이-OF-IRG-0003-2016) 및 NTU-NHG는 연구비 노화의 국립 의료 연구위원회 (:이 작품은 부분적으로 싱가포르 교육부 (부여 ARC9 / 15 등급 2)에서 보조금에 의해 지원되었다 그랜트 ARG / 14,017). 우리는 친절이 연구 가능 포장재을 우리에게 제공 박사 앤드류 알퍼트와 PolyLC 팀에 대한 우리의 감사와 가장 진심으로 감사의 말씀을드립니다.
Materials
| PolyCAT 3µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
Riferimenti
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