चिकन श्रवण ब्रेनस्टम में ओवो इलेक्ट्रोप्लोरेशन में

Summary

एवियन्स और स्तनधारियों के श्रवण तंत्रिकाय तंत्रों को तेजी से तंत्रिका एन्कोडिंग के लिए विशेष है, सामान्य सुनवाई कार्य के लिए एक मौलिक प्रक्रिया। ये न्यूरॉन्स भ्रूणीय अवरांति के अलग-अलग अग्रदूतों से उत्पन्न होते हैं। हम श्रवण विकास के दौरान जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए चिकन भ्रूण के अंतराल में जीन को व्यक्त करने के लिए इलेक्ट्रोपार्य का उपयोग करने वाली तकनीकें पेश करते हैं।

Abstract

इलेक्ट्रोपोरेशन एक ऐसा तरीका है जो चिकन भ्रूण जैसे जैविक रूप से प्रासंगिक जीवों में रुचि के जीन का परिचय देता है। यह लंबे समय से स्थापित है कि श्रवण प्रणाली के विकास के मूलभूत जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए चिकन भ्रूण एक प्रभावी शोध मॉडल है। हाल ही में, चिकन भ्रूण सुनवाई के साथ जुड़े जीन अभिव्यक्ति, विनियमन और समारोह का अध्ययन करने में विशेष रूप से मूल्यवान बन गया है। ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में अत्यधिक विशेष श्रवण कार्यों के लिए जिम्मेदार श्रवण ब्रेनस्टामी क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन क्षेत्रों में चिकन न्यूक्लियस मैन्गोसेल्यूलरिस (एनएम) और न्यूक्लियस लामिनारिस (एनएल) शामिल हैं। एनएम और एनएल न्यूरॉन्स rhombomeres 5 और 6 (आर 5 / आर 6) के अलग-अलग अग्रदूतों से उत्पन्न होते हैं। यहां, हम इन क्षेत्रों में जीन-संबंधित गुणों का अध्ययन करने के लिए प्लाज्मिड-एन्कोडेड जीन के ओवो इलेक्ट्रोप्लोरेशन में मौजूद हैं । हम आनुवंशिक अभिव्यक्ति के स्थानिक और अस्थायी नियंत्रण के लिए एक विधि दिखाते हैं जो कार्यात्मक फेनोटाइप के लाभ या हानि को बढ़ावा देते हैंतों। आर 5 / आर 6 से जुड़े श्रवण तंत्रिका पूर्वजों के क्षेत्रों को लक्षित करके, हम एनएम और एनएल में प्लाज्मिड अभिकर्मक दिखाते हैं। जीन अभिव्यक्ति का स्थाई नियम एक टीटी-ऑन वेक्टर सिस्टम को अपनाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। यह एक दवा अप्रभावी प्रक्रिया है जो डॉक्सिस्किलाइन (डॉक्स) की उपस्थिति में रुचि के जीनों को व्यक्त करती है। ओवो इलेक्ट्रोपायर तकनीक में – जैव रासायनिक, औषधीय, या विवो कार्यात्मक assays के साथ-साथ श्रवण न्यूरॉन विकास और संबंधित रोगप्राप्ति संबंधी घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

सामान्य श्रवण कार्यों के लिए ध्वनि की तीव्र तंत्रिका एन्कोडिंग आवश्यक है इसमें ध्वनि लोकिकीकरण क्षमता ¹ , शोर भेदभाव ² में भाषण, और अन्य व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक संचार संकेतों की समझ ^{3 शामिल है} । दोनों एवियन और स्तनधारियों के श्रवण ब्रेनस्ट्रेशन में स्थित एनालॉगस न्यूरॉन्स अत्यधिक न्यूरल एन्कोडिंग ^{4 के} लिए बेहद विशिष्ट हैं। इनमें चिकन न्यूक्लियस मैन्गोसेल्यूलरिस (एनएम), न्यूक्लियस लामिनारिस (एनएल) और उनके स्तनधारी एनालॉग, एंट्रोवेंट्रल कोक्लियर नाभिक (एवीसीएन) और औसत दर्जे का बेहतर जैतून (एमएसओ) क्रमशः ^{5 शामिल हैं} । हालांकि, तेजी से तंत्रिका एन्कोडिंग को विनियमित करने के विकास संबंधी तंत्र श्रवण ब्रेनस्टाम में बहुत कम समझ में आते हैं। इसलिए, यह विशिष्ट जीनों का अध्ययन करना फायदेमंद होता है जो तेजी से तंत्रिका एन्कोडिंग के लिए जिम्मेदार हैं ताकि उनकी अभिव्यक्ति, विनियमन और एयू में कार्य बेहतर ढंग से समझ सकें।Ditory विकास

विकासशील चिकन भ्रूण श्रवण प्रणाली के विकास के बुनियादी जैविक सवालों के अध्ययन के लिए एक प्रभावी और अच्छी तरह से स्थापित अनुसंधान उपकरण है ^{6 , 7} विवो जीन समारोह ^{8 , 9} में विश्लेषण करने के लिए हाल ही में आणविक अग्रिमों ने विकासशील चिकन भ्रूण में इन जैविक सवालों को संबोधित किया है या रुचि के जीनों को खटखटाया है। विशिष्ट जीनों की विनियामक भूमिका की जांच करना श्रवण घाटे से जुड़ा विद्वानों को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति है। यहां, हम चिकन-एन्कोडेड जीनों के ओवो इलेक्ट्रोप्लोरेशन में चिकन श्रवण ब्रेनस्टैंड में पेश करते हैं जहां ध्वनि की तीव्र तंत्रिका एन्कोडिंग ¹⁰ होती है। Rhombomeres 5 और 6 ^{11 , 12} (आर 5/5 के साथ जुड़े श्रवण तंत्रिका पूर्वज क्षेत्रों को लक्षित करके ^,आर 6), हम एनएम और एनएल में प्लाज्मिड अभिकर्मक के स्थानिक नियंत्रण दिखाते हैं। इसके अलावा, हम एक टीट-ऑन वेक्टर सिस्टम अपनाने के द्वारा अभिव्यक्ति का अस्थायी विनियमन दिखाते हैं। यह एक दवा अप्रभावी प्रक्रिया है जो डॉक्सिस्कीलाइन (डॉक्स) ⁸ की उपस्थिति में रुचि के जीनों को व्यक्त करता है

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था, और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ दिशानिर्देशों के अनुसार देखभाल और उपयोगशाला प्र?…

Representative Results

हम यहां दिखाते हैं कि ओवो इलेक्ट्रोपायर में सामान्य रूप से विकसित जैविक प्रणाली में जीन की अभिव्यक्ति परमिट होता है। प्लाज्मिड-एन्कोडेड जीन को न्यूरल ट्यूब ओवरलीइंग आर 5 / आर 6 में फोकल?…

Discussion

ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में विवो जीन फ़ंक्शन ^{8 , 9} में विश्लेषण करने के लिए ब्याज की जीन को व्यक्त या दबाने की एक विधि है। चिकन भ्रूण में, यह प्लास्मिड-एन्कोडेड जीन को विभिन्न…

Materials

Fertilized white leghorn chicken eggs	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil syringe needles	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Air tank/regulator	NU Laboratory Services		Air dry 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Clear plastic tape	Scotch	191
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D9891-1G
Egg refrigerator	Vissani Wine Refrigerator		13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator	Hova-Bator		37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
Micromanipulators	Narishige Japan	Model: MM-3	2 Micromanipulators
Capillary tubes	Sutter Instrument	BF150-86-10	Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes			1 mL, 3 mL
Needles	BD Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps	Stoelting		No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder	Custom Made		Clay base works as well
Micropipette puller	Sutter Instrument		Model P-97
Syringe filter	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm