Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained<em> Tribolium castaneum</em> embryons

Summary

L'imagerie de la morphogenèse des embryons d'insectes avec la microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière est devenu état de la technique. Ce protocole décrit et compare trois techniques de montage appropriées pour les embryons Tribolium castaneum, introduit deux nouvelles lignées transgéniques sur mesure bien adapté pour l' imagerie en direct, discute des contrôles de qualité essentiels et indique les limites expérimentales actuelles.

Abstract

Le coléoptère rouge de la farine Tribolium castaneum est devenu un important organisme modèle d'insectes en génétique du développement et de la biologie évolutive du développement. L'observation des embryons Tribolium par microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière présente de multiples avantages par rapport à grand champ classique et la microscopie par fluorescence confocale. En raison des propriétés uniques d'un microscope à base de feuille de lumière, images en trois dimensions de spécimens vivants peuvent être enregistrés avec des taux élevés de signal sur bruit et considérablement réduit photo-blanchiment, ainsi que la photo-toxicité ainsi que de multiples directions sur des périodes qui durent plusieurs journées. Avec plus de quatre années de développement méthodologique et une augmentation continue des données, le temps semble approprié d'établir des procédures normalisées d'exploitation pour l'utilisation de la technologie de feuille de lumière dans la communauté Tribolium, ainsi que dans la communauté des insectes en général. Ce protocole décrit trois techniques de fixation appropriées fou des buts différents, présente deux nouveaux faits sur mesure lignes Tribolium transgéniques approprié pour l' imagerie en temps réel à long terme, suggère cinq colorants fluorescents pour étiqueter les structures intracellulaires d'embryons fixe et fournit des informations sur le post-traitement de données pour l'évaluation en temps opportun des données enregistrées. Les résultats représentatifs se concentrent sur l'imagerie en temps réel à long terme, le sectionnement optique et l'observation de l'embryon même le long de multiples directions. Les ensembles de données respectifs sont fournis en tant que ressource téléchargeable. Enfin, le protocole discute des contrôles de qualité pour les tests d'imagerie en direct, les limites actuelles et l'applicabilité des procédures décrites à d'autres espèces d'insectes.

Ce protocole est principalement destiné aux biologistes du développement qui cherchent des solutions d'imagerie qui surclassent matériel de laboratoire standard. Elle favorise la tentative continue de combler l'écart entre les laboratoires de type technique / communautés, qui se développent et affinent micro-ordinateurscopier méthodologiquement, et les laboratoires de sciences de la vie / communautés, qui exigent des solutions « plug-and-play » aux défis techniques. En outre, il soutient une approche axiomatique qui déplace les questions biologiques dans le centre d'attention.

Introduction

Le tribolium rouge Tribolium castaneum, qui appartient à la grande famille des ténébrions (Tenebrionidae), a une longue histoire dans les sciences agricoles et de la vie et est le deuxième meilleur étudié organisme modèle d'insecte modèle après la mouche Drosophila melanogaster. Au cours des quatre dernières décennies, il est devenu un organisme modèle d'insecte puissant et populaire en génétique du développement, en biologie du développement et de l'évolution, au cours des vingt dernières années, dans la morphogenèse embryonnaire pour diverses raisons:

Drosophile et Tribolium appartiennent tous deux à la Holometabola, mais il y a divergé environ 300 millions d' années ^{1, 2, 3, 4.} Alors que le développement embryonnaire de la drosophile est généralement considérée comme hautement dérivée, Tribolium montre un mode plus ancestral develpement qui se trouve dans une proportion beaucoup plus importante d'espèces d' insectes ^{5, 6, 7, 8, 9.} Tout d' abord, Tribolium présente le développement de tête non involution, à savoir ses pièces buccales et des antennes apparaissent déjà pendant l' embryogenèse ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} En second lieu , Tribolium suit les principes de développement à court germe, à savoir les segments abdominaux sont ajoutés séquentiellement à partir d' une zone de croissance postérieure au cours de l' élongation de germband ^{16, 17, 18, 19.} Troisièmement, Tribolium se développe et plus tard se dégradedeux membranes extra-embryonnaires à savoir l'amnios, qui couvre seulement l'embryon ventralement et la séreuse, qui enveloppe complètement l'embryon ^{20, 21, 22.} Les deux membranes jouent un morphogénétique essentiel ²³ ainsi que le rôle de protection contre les micro – organismes ^{24, 25} et ²⁶ dessication. En quatrième lieu , les jambes en développement sont pleinement fonctionnelles embryonnairement au cours de la phase de la vie larvaire et servent de primordia pour les jambes des adultes pendant la métamorphose des chrysalides ^{27, 28, 29, 30, 31.}

En raison de leur petite taille et modestes exigences, la culture de Tribolium dans le laboratoire est assez simple. Les cultures de type sauvage (WT) des souches ou des lignées transgéniques se composent typiquement d'environ 100 à 300 adultes et peut être maintenue dans des bouteilles en verre d' un litre (empreinte 80 cm ²⁾ remplie de trois à quatre centimètres (environ 50 g) avec un milieu de croissance qui se compose de blé pleine fleur la farine complétée par la levure sèche inactive. Un approvisionnement en eau n'est pas nécessaire. Cela permet même de petits laboratoires de garder des dizaines de cultures de coléoptère dans les petites ou moyennes pépinières d'insectes disponibles dans le commerce. Stades de développement ultérieurs de Tribolium (larves après environ le quatrième stade, les nymphes et les adultes) sont facilement séparées du milieu de croissance par tamisage. embryons synchronisés sont obtenus en incubant les adultes pour une courte période sur un milieu de ponte. Pour un développement rapide, les cultures de dendroctones sont maintenus à 32 ° C (environ quatre semaines par génération), tout en maintenant des actions est généralement réalisée à 22-25 ° C (environ dix semaines par génération).

Dans la dernière décennie, de nombreux tec standardsLes techniques ont été progressivement adaptées et optimisées pour Tribolium , résumées dans les livres des Organismes Emergents ³² . Les méthodes génétiques avancées, telles que les cellules embryonnaires ³³ , les larves ^{34 , 35} ou les générations parentales ^{36 , 37 , les} anomalies à l'ARN, la transformation de la ligne germinale avec le système PiggyBac ^{38 , 39} ou Minos ⁴⁰ transposase et le génome CRISPR / Cas9 Ingénierie ⁴¹ . En outre, le génome de Tribolium a été séquencé il y a environ une décennie ⁴² , et est maintenant dans la troisième version de l' assemblage du génome ⁴³ , qui permet une identification efficace et génomique et une analyse systématique des gènes ⁴⁴ </sup> ou d' autres éléments génétiques ^{45, 46.} De plus, les génomes de quatre autres espèces de Coléoptères sont disponibles pour les approches génétiques comparatives ^{47, 48, 49, 50.} En association avec le génome séquencé, deux analyses génétiques à grande échelle ont été réalisées, à savoir un écran de mutagenèse insertionnelle ⁵¹ et un écran knockdown de gène à base d' interférence d'ARN systématique ^{52, 53.}

Imagerie en temps réel de la fluorescence avec grand champ, ou la microscopie confocale à base de feuille de lumière (LSFM) permet d'observer la morphologie embryonnaire de Tribolium en fonction du temps ( par exemple la morphogenèse) dans un contexte multi-dimensionnelle (Tableau 1). En microscopie Widefield et fluorescence confocale, la EXCITation et de la lumière d'émission est guidé par la même lentille d'objectif. Dans les deux approches, l'échantillon entier est éclairé pour chaque enregistrement plan en deux dimensions. Par conséquent, les échantillons sont soumis à des niveaux d'énergie très élevés. Dans LSFM, seuls les fluorophores dans le plan focal sont excités en raison d'un découplage de l' éclairage et la détection à l'aide de deux lentilles d' objectif disposées perpendiculairement (figure 1). LSFM est disponible en deux implémentations canoniques – le microscope d'éclairage seul plan (SPIM) et le microscope de fluorescence à base de feuille de lumière laser balayé numérique (DSLM, Figure 2) – et offre plusieurs avantages essentiels par rapport aux approches traditionnelles: (i) la capacité de sectionnement optique intrinsèque, (ii) une bonne résolution axiale, (iii) a fortement réduit le niveau de photo-blanchiment, (iv) une très faible photo-toxicité, (v) rapport signal-bruit, (vi) la vitesse d'acquisition relativement élevée, (vii) imagerie le long de multiples directions et (viii) la pénétration des tissus plus profonds en raison de l'utilisation de lentilles d' objectif d'illumination faible ouverture numérique ^{54, 55, 56.}

LSFM a déjà été appliquée avec succès dans Tribolium pour documenter presque toute la morphogenèse embryonnaire ⁵⁷ et d'analyser les principes de la rupture de la membrane extra-embryonnaire au début de la fermeture dorsale ^23. Pour augmenter l'attractivité de LSFM dans la communauté Tribolium et pour la science des insectes en général, il est d' une grande importance d'établir des procédures normalisées d'exploitation et d'améliorer les méthodes, les protocoles et le bassin de ressources à un niveau où le microscope devient une facilité de -utiliser outil standard dans les laboratoires de biologie du développement, et les questions biologiques restent au centre de l'attention.

Ce protocole commence par les bases de Tribolium </ em> la culture, à savoir l' entretien, la reproduction et la collecte d'embryons. Ensuite, deux stratégies expérimentales sont illustrées: (i) de formation d'image en direct de lignées transgéniques sur mesure et (ii) l' imagerie d'embryons fixes qui ont été colorées avec des colorants fluorescents (tableau 2). Par la suite, trois techniques de montage avec des fins légèrement différentes sont expliqués en détail (figure 3 et tableau 3): (i) la colonne d' agarose, (ii) l'hémisphère agarose et (iii) le nouveau support de toile d' araignée. Le protocole explique ensuite la procédure d'acquisition de données avec LSFM. modalités d'imagerie et considérations clés sont décrites. Enfin, la recherche sur l'embryon est expliqué et suggestions pour le traitement des données de base sont fournis. Dans les résultats représentatifs, les données d'imagerie en direct de deux nouveaux faits sur mesure et les lignées transgéniques Glie bleu ⁵⁸ sont représentés et les ensembles de données d'imagerie respectifs sont fournis en tant que ressource téléchargeable. De plus, l'imagedonnées d'embryons fixes qui ont été colorés avec une variété de colorants de fluorescence sont présentés. La discussion porte sur le contrôle de la qualité, les limites actuelles de l'approche d'imagerie en direct et l'adaptation du protocole à d'autres espèces.

Le protocole est écrit pour microscopes à fluorescence à base de feuilles de lumière qui sont équipés d'une chambre d'échantillon et un mécanisme de serrage pouvant tourner pour les détenteurs normalisés d'échantillons ^{54, 59, 60,} qui sont typiquement des éléments en forme de cylindre en métal, en plastique ou en verre ayant un diamètre dans l'ordre du millimètre. Le protocole est également approprié pour les deux implémentations canoniques, soit SPIM et DSLM, ainsi que pour une configuration avec deux ou plusieurs bras d'illumination et de détection ^{61, 62, 63.} Les résultats représentatifs montrent les données dans deux canaux spectraux, vert (illumination avec un laser de 488 nm, la détection à travers un filtre passe-bande 525/50) et rouge (illumination avec un laser 561 nm, détection à travers un filtre passe-bande 607/70), mais le protocole peut être étendu à trois ou quatre canaux spectraux.

Protocol

1. Élevage des cultures Tribolium REMARQUE: Les conditions standard sont définies comme une température d'incubation de 25 ° C et 70% d'humidité relative dans un 12 h / 12 h lumineux de cycle sombre. Pour plus d' informations sur l' élevage Tribolium, les lignes directrices respectives sont disponibles 64. Ce protocole nécessite deux supports à base de farine différentes, qui peuvent être préparées en quantités de kilogramm…

Representative Results

Ce protocole décrit un cadre expérimental pour l' imagerie de fluorescence de la vie ou fixées et colorées avec des embryons Tribolium LSFM. En raison des faibles niveaux de photo-blanchiment et photo-toxicité, une conséquence directe de sa capacité de sectionnement optique, LSFM est particulièrement bien adapté pour l'imagerie en direct à long terme. Le nouveau AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 lign?…

Discussion

Contrôle de qualité

Dans des essais de formation d'image en direct, la préparation et la procédure d' enregistrement doit être non invasive, à savoir ni la mécanique et la manipulation chimique (collecte, dechorionation, le montage sur le porte-échantillon) , ni la charge énergétique intégrée pendant l'observation devrait affecter la viabilité de l'échantillon. Pour les études qui caractérisent le développement WT, il est recommandé…

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive