Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em> Tribolium castaneum</em> Embryo's

Summary

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Abstract

De rode Tribolium castaneum is uitgegroeid tot een belangrijke insect modelorganisme in ontwikkelings-genetica en de evolutionaire ontwikkelingsbiologie. De waarneming van Tribolium embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie heeft meerdere voordelen ten opzichte van conventionele groothoek en confocale fluorescentiemicroscopie. Vanwege de unieke eigenschappen van een licht-sheet based microscoop, kunnen driedimensionale beelden van levende exemplaren worden opgenomen met hoge signaal-ruisverhouding en een aanzienlijk verlaagde foto-bleking en foto- toxiciteit langs meerdere richtingen gedurende perioden dat verschillende duren dagen. Met meer dan vier jaar van ontwikkeling van de methodiek en een continue toename van data, lijkt het geschikt moment in standard operating procedures vast te stellen voor het gebruik van licht plaat technologie in de Tribolium gemeenschap als in het insect gemeenschap in het algemeen. Dit protocol beschrijft drie bevestigingstechnieken geschof andere doeleinden, presenteert twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen Tribolium geschikt voor langdurige levende beeldvorming, stelt vijf fluorescerende kleurstoffen intracellulaire structuren vaste embryo label verschaft informatie aangaande data naverwerking voor de tijdige evaluatie van de geregistreerde gegevens. Representatieve resultaten concentreren op de lange termijn live-imaging, optische sectie en de observatie van dezelfde embryo langs meerdere richtingen. De respectieve datasets worden geleverd als downloadbare bron. Tenslotte beschrijft het protocol kwaliteitscontroles voor levende beeldvormende assays huidige beperkingen en de toepasbaarheid van de beschreven procedures met andere insectensoorten.

Dit protocol is vooral bedoeld voor ontwikkelingsstoornissen biologen die imaging oplossingen die standaard laboratoriumapparatuur overtreffen zoeken. Het bevordert de continue poging om de kloof tussen de technisch georiënteerde laboratoria / gemeenschappen, die zich ontwikkelen en verfijnen micro sluitenkopiëren methodologisch, en de life science laboratoria / gemeenschappen, die 'plug-and-play' oplossingen voor technische uitdagingen vereisen. Bovendien ondersteunt een axiomatische benadering die de biologische vraagstukken in het middelpunt van de aandacht beweegt.

Introduction

De rode Tribolium castaneum, die behoort tot de grote familie van zwartlijfkevers (Tenebrionidae), heeft een lange geschiedenis binnen de landbouw- en biowetenschappen en is het tweede best bestudeerde model insect modelorganisme na de vrucht Drosophila melanogaster vliegen. Gedurende de laatste vier decennia, het werd een krachtige en populaire insect modelorganisme in ontwikkelingsstoornissen genetica, in de evolutionaire ontwikkelingsbiologie en tijdens de laatste twintig jaar, in embryonale morfogenese voor een verscheidenheid van redenen:

Drosophila en Tribolium behoren beide tot de Holometabola, maar gedivergeerd ongeveer 300 miljoen jaar geleden ^{1, 2, 3, 4.} Terwijl de embryonale ontwikkeling van Drosophila algemeen wordt beschouwd als zeer afgeleid, Tribolium toont een voorouderlijke vorm van ontling die in een aanzienlijk groter deel van insectensoorten ^{5, 6, 7, 8, 9.} Enerzijds, Tribolium vertoont niet-involutie head ontwikkeling, namelijk de monddelen en antennes reeds ontstaan tijdens embryogenese ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Ten tweede, Tribolium de beginselen van korte kiem ontwikkeling, namelijk buiksegmenten worden achtereenvolgens een achterste groeizone tijdens germband rek ^{16, 17, 18, 19.} Ten derde, Tribolium ontwikkelt en later degradeerttwee extra-embryonale membranen dwz het amnion, die het embryo enige ventraal bedekt en de serosa, waarbij het embryo volledig omhult ^{20, 21, 22.} Beide membranen spelen een cruciale morfogenetische ²³ en de beschermende rol tegen micro-organismen ^{24, 25} en ²⁶ uitdroging. Ten vierde, de embryonale ontwikkeling benen volledig functioneel tijdens het larvale levensfase en dienen als primordia voor de volwassen benen tijdens pupal metamorfose ^{27, 28, 29, 30, 31.}

Door hun geringe omvang en bescheiden eisen, de teelt van Tribolium in het laboratorium is vrij eenvoudig. Culturen van wildtype (WT) stammen of transgene lijnen gewoonlijk uit ongeveer 100-300 volwassenen en kan binnen één liter glazen flessen (footprint 80 ^cm2) gevuld 3-4 cm hoog (ongeveer 50 g) met groeimedium dat uit volledige korreltarwe bewaard meel aangevuld met actieve droge gist. Een watertoevoer is niet nodig. Dit maakt het mogelijk zelfs kleine laboratoria om tientallen kever culturen binnen kleine of middelgrote handel verkrijgbaar insect incubators te houden. Later ontwikkelingsstadia van Tribolium (larven na ongeveer het vierde stadium, poppen en volwassenen) zijn gemakkelijk gescheiden van het groeimedium door zeven. Gesynchroniseerde embryo's worden verkregen door het incuberen volwassenen kortstondig op eierleggende medium. Voor snelle ontwikkeling, worden kever kweken bij 32 ° C (ongeveer vier weken per generatie) gehouden, terwijl voorraadbeheer typisch uitgevoerd bij 22-25 ° C (ongeveer tien weken per generatie).

In de afgelopen tien jaar veel standaard techniques zijn geleidelijk aangepast en geoptimaliseerd voor Tribolium, zoals samengevat in de Emerging Modelorganismen boeken ^32. Van groot belang voortbewogen genetische werkwijzen zoals embryonale ^33, larvale ^{34, 35} of ouderlijke ^{36, 37} RNA-interferentie genexpressie knockdown kiemlijn transformatie met ofwel de piggyBac ^{38, 39} of Minos ⁴⁰ transposase systeem CRISPR / Cas9 gebaseerde genoom ⁴¹ techniek. Voorts is de Tribolium genoom gesequenced ongeveer tien jaar geleden ^42, en is nu in de derde ronde van genoom samenstel los ^43, die efficiënt en genoom-brede identificatie en systematische analyse van genen mogelijk maakt ⁴⁴ </sup> of andere genetische elementen ^{45, 46.} Bovendien, de genomen van vier andere soorten coleoptera zijn vergelijkende genetische benaderingen ^{47, 48, 49, 50.} In samenwerking met de gesequenced genoom, hebben twee grote genetische analyses uitgevoerd, namelijk een insertie mutagenese scherm ⁵¹ en een systematische RNA interferentie-genexpressie knockdown scherm ^{52, 53.}

Fluorescentie levende beeldvorming met groothoek, confocale of lichte vel gebaseerde microscopie (LSFM) maakt het mogelijk om de morfologie van embryonale Tribolium acht als functie van de tijd (de morfogenese) in een multi-dimensionele context (tabel 1). In groothoek en confocale fluorescentie microscopie, de Excitatie en emissie licht wordt geleid door dezelfde objectieflens. In beide benaderingen wordt het gehele monster verlicht elke geregistreerde tweedimensionale vlak. Derhalve worden de monsters onderworpen aan zeer hoge energieniveaus. In LSFM alleen de fluoroforen in het brandvlak worden geëxciteerd door een ontkoppeling van belichting en detectie door twee loodrecht objectieflenzen (figuur 1). LSFM komt in twee canonieke implementaties – de enkel vlak belichting microscoop (SPIM) en de digitale gescande laserlicht vel basis fluorescentiemicroscoop (DSLM figuur 2) – en biedt een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van traditionele werkwijzen: (i) intrinsieke optische sectie vermogen, (ii) goede axiale resolutie, (iii) sterk verlaagd niveau van foto-bleken, (iv) lage foto-toxiciteit, (v) een hoge signaal-ruisverhouding, (vi) een relatief hoge meetsnelheid, (vii) beeldvorming langs meerdere richtingen en (viii) diepere penetratie dankzij het gebruik van lage numerieke apertuur verlichtingsobjektiefstelsel lenzen ^{54, 55, 56.}

LSFM is al met succes toegepast in Tribolium tot bijna het gehele embryonale morfogenese ⁵⁷ te documenteren en aan de principes van extra-embryonale membraan breuk aan het begin van dorsale sluiting ²³ te analyseren. Om de aantrekkelijkheid van LSFM verhogen in de Tribolium gemeenschap en voor insecten wetenschap in het algemeen, is het van groot belang is voor standard operating procedures vast te stellen en de methoden, protocollen en het zwembad van de middelen om een niveau te verbeteren waar de microscoop wordt een gemak-of -gebruik standaard instrument in ontwikkelingsbiologie laboratoria, en de biologische vragen verblijven in het centrum van de belangstelling.

Dit protocol begint met de basisprincipes van Tribolium </ em> teelt, dwz het onderhoud, de voortplanting en embryo collectie. Vervolgens worden twee experimentele strategieën toegelicht: (i) levende beeldvorming van op maat gemaakte transgene lijnen en (ii) beeldvorming vaste embryo's die werden gekleurd met fluorescente kleurstoffen (Tabel 2). Vervolgens drie bevestigingstechnieken met lichtjes verschillende doeleinden worden toegelicht (figuur 3 en tabel 3): (i) het agarosekolom, (ii) de agarose halfrond en (iii) het nieuwe spinnenweb houder. Het protocol legt vervolgens de data acquisitie procedure LSFM. Beeldvormende modaliteiten en de belangrijkste overwegingen zijn geschetst. Tenslotte wordt embryo retrieval uitgelegd en suggesties voor basisgegevens transformatie worden geleverd. In de representatieve resultaten, actuele beeldgegevens van twee nieuwe maat en Glia-blauwe ⁵⁸ transgene lijnen weergegeven en de bijbehorende datasets beeldvorming verschaft als downloadbare bron. Bovendien, imagegegevens van vaste embryo's die werden gekleurd met verschillende fluorescentie kleurstoffen worden gepresenteerd. De discussie richt zich op de kwaliteitscontrole, de huidige beperkingen van de live-imaging benadering en de aanpassing van het protocol bij andere soorten.

Het protocol is bestemd voor lichte plaat gebaseerde fluorescentie microscopen die zijn voorzien van een monsterkamer en een draaibaar klemmechanisme gestandaardiseerde monsterhouders ^{54, 59, 60,} die typisch cilindervormige elementen van metaal, kunststof of glas met een diameter in het millimeterbereik. Het protocol is geschikt voor canonische implementaties, namelijk SPIM en DSLM, alsmede voor opstellingen met twee of meer belichting en detectie armen ^{61, 62, 63.} De representatieve resultaten tonen gegevens in twee spektraalkanalen, groen (illumination met een 488 nm laser detectie door een 525/50 banddoorlaatfilter) en rode (belichting met een 561 nm laser detectie door een 607/70 banddoorlaatfilter), maar het protocol kan worden uitgebreid tot drie of vier spektraalkanalen.

Protocol

1. Veehouderij van Tribolium Cultures OPMERKING: Standaard omstandigheden worden gedefinieerd als een incubatietemperatuur van 25 ° C en 70% relatieve vochtigheid in een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus. Voor meer informatie over Tribolium en veeteelt, de respectieve richtlijnen beschikbaar 64. Dit protocol vereist twee verschillende op meel gebaseerde media, dat kan worden bereid kilogramhoeveelheden en houdbaarheid van meerdere maanden. <…

Representative Results

Dit protocol beschrijft een experimenteel kader voor fluorescentie beeldvorming van levende of gefixeerd en gekleurd Tribolium embryo's met LSFM. Vanwege de lage foto-bleken en foto-toxiciteit, een direct gevolg van de optische sectie vermogen, LSFM bijzonder geschikt voor langdurig leven beeldvorming. De nieuwe AGOC {ATub'H2B-mEmerald} nr.1 transgene lijn brengt een histone2B mEmerald-fusie-eiwit onder contro…

Discussion

Kwaliteitscontrole

In levende beeldvormende assays, moet het preparaat en registratieprocedure niet-invasief, dat wil zeggen noch de mechanische en chemische hanteren (verzamelen, dechorionation, montage op de monsterhouder) noch de geïntegreerde lading energie tijdens de waarneming de levensvatbaarheid van het preparaat moeten beïnvloeden. Voor studies die kenmerkend WT ontwikkeling, is het raadzaam om alleen gegevens uit experimenten waarin het embryo overleeft …

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive