Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em> Tribolium castaneum</em> Embry

Summary

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Abstract

Der rote Mehlkäfer Tribolium castaneum ist zu einem wichtigen Insektenmodellorganismus in der Entwicklungsgenetik und Evolutionsentwicklungsbiologie worden. Die Beobachtung von Tribolium Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Weitfeld- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften eines Lichtbogenbasierten Mikroskop dreidimensionale Bilder lebender Proben mit hohem Signal-Rausch-Verhältnisse und eine deutlich reduzierte Photobleich sowie Phototoxizität entlang mehrerer Richtungen über Perioden aufgezeichnet werden, die mehrere dauern Tage. Mit mehr als vier Jahren der methodischen Entwicklung und eine kontinuierlichen Steigerung von Daten, scheint die Zeit entsprechende Standardarbeitsanweisungen für die Verwendung von Lichtblatt – Technologie in der Tribolium Gemeinschaft zu etablieren sowie in den Insekt Gemeinschaft. Dieses Protokoll beschreibt drei Montagetechniken geeignet foder verschiedene Zwecke, stellt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien Tribolium geeignet für Langzeit – Echtzeit- Bildgebung, schlägt fünf Fluoreszenzfarbstoffe intrazelluläre Strukturen von festen Embryonen etikettieren und liefert Informationen über die Daten Nachverarbeitung für die rechtzeitige Auswertung der aufgezeichneten Daten. Repräsentative Ergebnisse konzentrieren sich auf die langfristige Echtzeit-Bildgebung, optischen Schneidens und der Beobachtung des gleichen Embryos entlang mehrerer Richtungen. Die entsprechenden Datensätze werden als herunterladbare Ressource bereitgestellt. Schließlich beschreibt das Protokoll Qualitätskontrollen für Echtzeit-Bildgebung Assays aktuellen Einschränkungen und die Anwendbarkeit der beschriebenen Verfahren auf andere Insektenarten.

Dieses Protokoll wird für Entwicklungsbiologen in erster Linie gedacht, die Imaging-Lösungen suchen, die Standard-Laborgeräte entwickeln. Es fördert den kontinuierlichen Versuch, die Lücke zwischen den technisch orientierten Laboratorien / Gemeinden zu schließen, die sich entwickeln und Mikros verfeinernKopieren methodologisch und das Life-Science-Labor / Gemeinden, die technischen Herausforderungen 'Plug-and-Play' Lösungen erfordern. Darüber hinaus unterstützt es einen axiomatischen Ansatz, der die biologischen Fragen in den Mittelpunkt der Aufmerksamkeit bewegt.

Introduction

Die rote Mehlkäfer Tribolium castaneum, die von Schwarzkäfer (Tenebrionidae) zur großen Familie gehört, hat eine lange Geschichte in der Landwirtschaft und Lebenswissenschaften und ist die zweite am besten untersuchte Modell Insektenmodellorganismus nach der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. In den letzten vier Jahrzehnten wurde es ein starker und beliebtes Insekt Modellorganismus in der Entwicklungsgenetik, in der evolutionären Entwicklungsbiologie und in den letzten zwanzig Jahren in der embryonalen Morphogenese für eine Vielzahl von Gründen:

Drosophila und Tribolium gehören beide zur Holometabola, aber etwa 300.000.000 Jahre wichen vor ^{1, 2, 3, 4.} Während die embryonale Entwicklung von Drosophila allgemein als hoch abgeleitet betrachtet wird, zeigt einen Tribolium Vorfahren Modus Entwicklung , die in einem deutlich größeren Anteil an Insektenart ^{5, 6, 7, 8, 9} zu finden ist. Erstens weist Tribolium nicht-involuted Kopfentwicklung, dh seine Mundwerkzeuge und Antennen entstehen bereits während der Embryonalentwicklung ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Zweitens folgt Tribolium die Prinzipien der Kurzkeimentwicklung, dh Abdominalsegmente ¹⁶ sind der Reihe nach von einer posterioren Wachstumszone während germband Dehnung ^{hinzugefügt, 17, 18, 19.} Drittens entwickelt Tribolium und später degradiertzwei extraembryonalen Membranen dh das Amnion, das nur den Embryo ventral abdeckt und der Serosa, die den Embryo vollständig einhüllt ^{20, 21, 22.} Beide Membranen spielen eine entscheidende morphogenetischen ²³ sowie Schutzfunktion gegen Mikroorganismen ^{24, 25} und Austrocknungs ^26. Viertens sind die embryonal Entwicklungs Beine während des Larvenentwicklungsstadium voll funktionsfähig und dienen als Primor für den erwachsenen Beine während pupal Metamorphose ^{27, 28, 29, 30, 31.}

Aufgrund ihrer geringen Größe und bescheidenen Forderungen, Anbau von Tribolium im Labor ist recht unkompliziert. Kulturen von Wildtyp (WT) Stämme oder transgenen Linien besteht typischerweise von etwa 100-300 Erwachsenen und kann innerhalb von Ein-Liter – Glasflaschen (footprint 80 cm ²⁾ gefüllt drei vor vier Zentimetern hoch (etwa 50 g) mit Wachstumsmedium gehalten werden , das aus Vollkornweizen besteht Mehl mit inaktiver Trockenhefe ergänzt. Eine Wasserversorgung ist nicht erforderlich. Auf diese Weise kann auch kleine Laboratorien Dutzende von Käfern Kulturen innerhalb kleinen oder mittelgroßen Handel erhältlich Insekten Inkubatoren zu halten. Späteren Entwicklungsstadien von Tribolium (Larven nach etwa der vierten Larvenstadium, Puppen und Adulte) leicht aus dem Wachstumsmedium durch Sieben getrennt. Synchronisierte Embryonen erhalten von Erwachsenen für eine kurze Zeit auf Eiablage Medium inkubiert. Für die schnelle Entwicklung, Käfer Kulturen werden bei 32 ° C (etwa vier Wochen pro Generation) gehalten, während der Lagerhaltung typischerweise bei 22 bis 25 ° C (etwa 10 Wochen pro Generation) durchgeführt wird.

Innerhalb der letzten zehn Jahre, viele Standard-techniques wurden für Tribolium allmählich angepasst und optimiert, wie ³² in den Schwellenmodellorganismen Bücher zusammengefasst. Von großer Bedeutung sind genetische Methoden vorgeschoben , wie beispielsweise embryonale ^33, Larven ^{34, 35} oder Eltern ^{36, 37} RNA – Interferenz-basierte Knock-Down, mit Keimbahn – Transformation entweder das ^{38 piggyBac, 39} oder dem Minos ⁴⁰ Transposase – System und CRISPR / Cas9 basierter Genom Technik ^41. Darüber hinaus hat der Tribolium Genom etwa ein Jahrzehnt ⁴² her sequenziert worden und ist nun in der dritten Runde der Genomanordnung ⁴³ freizugeben, die ⁴⁴ effizient und genomweite Identifikation und systematische Analyse von Genen ermöglicht , </sup> oder andere Elemente genetische ^{45, 46.} Darüber hinaus sind die Genome von vier anderen Coleoptera – Spezies für vergleichende genetische Ansätze ^{47, 48, 49, 50.} In Verbindung mit dem sequenzierten Genom, zwei großen genetischen Analysen dh einen Insertionsmutagenese Bildschirm ⁵¹ und ein systematischen RNA – Interferenz basierenden Knock-Down – Bildschirm ⁵² durchgeführt ^{wurden, 53.}

Fluoreszenz Echtzeit- Bildgebung mit Weitfeld-, konfokaler oder Lichtbogen-Basis – Mikroskopie (LSFM) ermöglicht die embryonale Morphologie von Tribolium als Funktion der Zeit (dh die Morphogenese) in einem mehrdimensionalen Kontext (Tabelle 1) zu beobachten. In Weitfeld- und konfokale Fluoreszenzmikroskopie, die excitation und Emissionslicht wird durch die gleiche Objektivlinse geführt wird. Bei beiden Ansätzen wird die gesamte Probe für jede aufgenommene zweidimensionale Ebene beleuchtet. Somit werden die Proben auf eine sehr hohe Energieniveaus ausgesetzt. In LSFM nur die Fluorophore in der Fokusebene sind auf eine Entkoppelung der Beleuchtung und Detektion angeregt durch Verwendung von zwei senkrecht zueinander angeordneten Objektivlinsen (Abbildung 1). LSFM kommt in zwei kanonische Implementierungen – die einzige Ebene Beleuchtungsmikroskop (SPIM) und das digitale abgetastete Laserlichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskop (DSLM, Bild 2) – und bietet mehrere entscheidende Vorteile gegenüber traditionellen Herangehensweisen: (i) intrinsische optischen Schneidens fähig, (ii) ein gutes axiale Auflösung, (iii) stark reduzierter Gehalt an Photobleich, (iv) sehr geringe Phototoxizität, (v) hohe Signal-zu-Rausch-Verhältnis, (vi) relativ hohe Erfassungsgeschwindigkeit, (vii) -Bildgebung entlang mehrerer Richtungen und (viii) tiefere Gewebepenetration durch die Verwendung von niedrigeren numerischen Apertur Beleuchtungsobjektivlinsen ^{54, 55, 56.}

LSFM wird bereits in Tribolium zu dokumentieren fast den gesamten embryonalen Morphogenese ⁵⁷ und zu analysieren , um die Prinzipien der extraembryonalen Membranruptur zu Beginn des Rückenverschlusses ²³ erfolgreich eingesetzt. Um die Attraktivität der LSFM in der Tribolium Gemeinschaft und für Insekten Wissenschaft im Allgemeinen zu erhöhen, ist es von großer Bedeutung zu etablieren Standard – Betriebsverfahren und die Methoden, Protokolle und den Pool von Ressourcen auf ein Niveau zu verbessern , wo das Mikroskop ein wird die Einfachheit des -Nutzung Standardwerkzeug in der Entwicklungsbiologie Labors und die biologischen Fragen in den Mittelpunkt der Aufmerksamkeit bleiben.

Dieses Protokoll beginnt mit den Grundlagen von Tribolium </ em> Anbau, dh Wartung, Reproduktion und Embryo – Entnahme. Als nächstes werden zwei Versuchsstrategien dargestellt: (i) Echtzeit- Bildgebung von maßgeschneiderten transgenen Linien und (ii) Darstellung von festen Embryonen , die mit Fluoreszenzfarbstoffen (Tabelle 2) gefärbt wurden. (I) die Agarose – Säule, (ii) die Agarose Hemisphäre und (iii) der neuen Spinnweben Inhaber: Anschließend werden im Detail (Abbildung 3 und Tabelle 3) drei Befestigungstechniken mit leicht unterschiedlichen Zwecken erläutern. Das Protokoll erklärt dann den Einlesevorgang mit LSFM. Bildgebungsverfahren und wichtige Überlegungen skizziert. Schließlich wird Embryo Retrieval erklärt und Vorschläge für grundlegende Datenverarbeitung zur Verfügung gestellt werden. In den repräsentativen Ergebnissen, Livebilddaten von zwei neuartigen maßgefertigte und die Glia-blue ⁵⁸ transgene Linien gezeigt sind und die jeweiligen Abbildungsdatensätze werden als herunterladbare Ressource bereitgestellt. Zusätzlich BildDaten von Fest Embryonen, die mit einer Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt wurden vorgestellt. Die Diskussion konzentriert sich auf die Qualitätskontrolle, die derzeitigen Beschränkungen des Live-Imaging-Ansatz und die Anpassung des Protokolls zu anderen Arten.

Das Protokoll ist für die Lichtbogen-Basis geschrieben Fluoreszenzmikroskope , die mit einer Probenkammer und einer drehbaren Klemmmechanismus für standardisierte Probenhaltern ^{54, 59, 60,} ausgestattet, die mit einem Durchmesser von Metall, Kunststoff oder Glas bestehen typischerweise zylinderförmige Elemente sind , im Millimeterbereich. Das Protokoll ist auch geeignet für beide kanonische Implementierungen, das heißt SPIM und DSLM sowie für Aufbauten mit zwei oder mehr Beleuchtungs- und Detektionsarme ^{61, 62, 63.} Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, Daten, die in zwei spektralen Kanälen, grün (illumination mit einem 488 nm-Laser, Feststellung durch einen 525/50 Bandpaßfilters) und Rot (Beleuchtung mit einem 561-nm-Laser, Feststellung durch einen 607/70 Bandpaßfilters), aber das Protokoll kann auf drei oder vier spektrale Kanäle erweitert werden.

Protocol

1. Haltung von Tribolium Cultures HINWEIS: Standardbedingungen werden als eine Inkubationstemperatur von 25 ° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12 h definiert Hell / 12 h Dunkel-Zyklus. Weitere Informationen über die Tribolium Haltung, sind entsprechende Richtlinien 64 zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert zwei verschiedene Mehlbasis Medien, die in Kilogramm-Mengen und gespeichert für mehrere Monate vorbereitet werden kann. …

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Rahmen für die Fluoreszenzabbildung von lebenden oder fixierten und gefärbten Tribolium Embryonen mit LSFM. Aufgrund der geringen Mengen an Photobleichung und Phototoxizität, eine direkte Folge seiner optischen Schneidens Fähigkeit ist LSFM besonders gut geeignet für die Langzeitechtzeit-Bildgebung. Die neuartige Ágóc {ATub'H2B-mEmerald} # 1 transgene Linie …

Discussion

Qualitätskontrolle

In Echtzeit- Bildgebung Assays, muss die Herstellung und Aufzeichnungsverfahren nicht-invasiv sein, dh weder die mechanische und chemische Behandlung (Sammlung, dechorionation, auf die Probenhaltermontage) noch die integrierte Energiebelastung während der Beobachtung sollte die Lebensfähigkeit der Probe beeinflussen. Für Studien, die WT Entwicklung zu charakterisieren, ist es nur die Verwendung von Daten aus Experimenten empfohlen, in denen de…

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive