גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em> Tribolium castaneum</em> עובר

Summary

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

Abstract

Castaneum Tribolium חיפושית הקמח האדום הפך אורגניזם מודל חרקים חשוב בגנטיקה התפתחותית ביולוגיה התפתחותית אבולוציונית. התצפית של עוברי Tribolium עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון יש יתרונות רבים על פני widefield הקונבנציונלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. בשל המאפיינים הייחודיים של מיקרוסקופ גיליון מבוסס אור, שלוש תמונות ממדיות של דגימות חיות יכולות להיות מוקלטות עם יחס אות לרעש גבוה באופן משמעותי הלבנת תמונה וכן צילום רעיל לאורך כיוונים מרובים לאורך תקופות שנמשכות מספר ימים. עם יותר מארבע שנים של פיתוח מתודולוגיות ועלייה רציפה של נתונים, הפעם נראה מתאים להקים נהלי עבודה סטנדרטיים עבור השימוש בטכנולוגית גיליון אור בקהילת Tribolium כמו גם בקהילת החרקים רחבים. פרוטוקול זה מתאר שלוש טכניקות הרכבה מתאימות Fאו למטרות שונות, מציגות שתי שורות מחוייטת רומן מהונדסות Tribolium מתאימים הדמיה חי לטווח ארוך, מציעה חמישה צבעי ניאון לתייג מבנים תאיים של עוברים קבועים ומספקות מידע על עיבוד פוסט נתונים להערכה בזמן של הנתונים שנרשמו. תוצאות נציג להתרכז הדמיה חיה לטווח ארוך, חתך אופטי ואת התצפית של אותו העובר לאורך כיוונים מרובים. מערכי נתוני בהתאמה ניתנים כמשאב להורדה. לבסוף, הפרוטוקול דן בקרות איכות עבור מבחני הדמיה חיים, מגבלות נוכחיות ואת תחולת ההנחיות המתוארות כדי מינים של חרקים אחרים.

פרוטוקול זה מיועד בעיקר עבור ביולוגים התפתחותיים המבקשים פתרונות הדמיה כי להכות ציוד מעבדה סטנדרטי. זה מקדם את הניסיון המתמשך כדי לסגור את הפער בין / קהילות מעבדות חוקיות מבחינה הטכנית, אשר לפתח ולשכלל microsלהעתיק מתודולוגית, ואת מעבדות מדעי חיים / קהילות, אשר דורשות פתרונות "plug-and-play" אל אתגרים טכניים. יתר על כן, הוא תומך בגישה אקסיומטית שזזה השאלות הביולוגיות למרכז תשומת לב.

Introduction

חיפושית קמח אדום Tribolium castaneum, אשר שייך למש' הגדולה של חיפושיות אפלוליות (Tenebrionidae), יש היסטוריה ארוכה בתחום מדעי החקלאות וחיים והוא האורגניזם השני הכי טוב לומד מודל חרקי המודל אחרי זבוב הפרות תסיסנית. במהלך ארבעת העשורים האחרונים, זה הפך אורגניזם מודל החרק חזק ופופולרי בגנטיקה התפתחותית, בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, במהלך עשרים השנים האחרונות, ב morphogenesis העוברי עבור מגוון רחב של סיבות:

תסיסנית Tribolium שניהם שייכים Holometabola, אך נפרדו כ -300 מיליון שנים לפני ^{1, 2, 3, 4.} בעוד ההתפתחות העוברית של תסיסנית נחשבה בכינויו נגזר מאוד, Tribolium מציגה מצב אבות יותר של development שנמצא שיעור גבוה יותר משמעותית של מיני חרקים ^{5, 6, 7, 8, 9.} ראשית, Tribolium מציג פיתוח הראש הלא involuted, כלומר איברי הפה המחושים שלה לצוץ כבר במהלך העובר ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} שנית, Tribolium מלווה את העקרונות של פיתוח קצר נבט, כלומר קטעי בטן מתווספים ברצף מאזור הגידול האחורי במהלך התארכות germband ^{16, 17, 18, 19.} שלישית, Tribolium מפתחת מדרדרת מאוחרשתי ממברנות חוץ עוברי כלומר את amnion, אשר מכסה את העובר רק ventrally, ואת serosa, שעוטף את העובר לחלוטין ^{20, 21, 22.} ממברנות שניהם ממלאים המוךפו"גנטי שהולך מכריע ²³ כמו גם תפקיד המגן נגד מיקרואורגניזמים ^{24, 25} ו ²⁶ התייבשות. רביעית, הרגליים מתפתחות בעוברים פועלים באופן תקין לחלוטין בשלב בחיים הזחל לשמש primordia עבור הרגליים הבוגרת במהלך המטמורפוזה גלמי ^{27, 28, 29, 30, 31.}

בשל דרישות הגודל צנוע הקטנות שלהם, טיפוח Tribolium במעבדה הוא פשוט למדי. תרבויות של wild-type (WT) זנים או קווי מהונדס מכילים בדרך כלל סביב 100-300 מבוגרים יכולים להישמר בתוך בקבוקי זכוכית חד ליטר (טביעת 80 ס"מ ²⁾ מילא שלושה כדי בארבעה סנטימטרים גבוה (כ 50 גרם) עם מדיום הגידול הכולל של חיטה דגנים מלאים קמח בתוספת שמרים יבשים פעילים. צינור לאספקת מים אין צורך. זה מאפשר גם מעבדות קטנות כדי לשמור על עשרות תרבויות חיפושית בתוך אינקובטורים חרקים קטנים או בינוניים זמינים מסחרית. בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר Tribolium (זחלים אחרי בערך instar הרביעיים, גלמים ומבוגרים) מופרדים בקלות מן מדיום הגידול ידי סינון. עובר מסונכרן מתקבלים על ידי דוגרי מבוגרים לתקופות קצרות על מדיום הטלה. עבור פיתוח מהיר, תרבויות חיפושית נשמרות 32 ° C (כארבעה שבועות לכל דור), תוך שמירה על מניות מבוצעת בדרך כלל ב- C ° 22-25 (כעשרה שבועות לכל דור).

במשך העשור האחרון, tec סטנדרטי רבhniques הותאמו בהדרגה אופטימיזציה עבור Tribolium, כפי שמסוכם הספרים אורגניזמים מודל Emerging ^32. חשיבות רבה הם מתקדמים בשיטות גנטיות כגון ³³ עובריים, ^{34 זחל, 35} או ^{36 הורית, 37} RNA מציאת גן מבוסס הפרעה, טרנספורמציה germline גם עם ^{38 piggyBac, 39} או מערכת מינוס ⁴⁰ transposase ו קריספר / בגנום מבוסס Cas9 הנדסה ^41. יתר על כן, הגנום Tribolium כבר רצף לפני כעשור ^42, והיום הוא בסיבוב השלישי של הגנום הרכבה לשחרר ^43, אשר מאפשר זיהוי יעיל הגנום כולו וניתוח שיטתי של גנים ⁴⁴ </sעד> או אלמנטים גנטיים אחרים ^{45, 46.} בנוסף, את הגנומים של ארבעה מינים קשים כנפיים התפוצצו בפניו אחרים זמינים עבור גישות גנטיות השוואתיות ^{47, 48, 49, 50.} בשיתוף עם הגנום הרצף, שני ניתוחים גנטיים גדולים בוצעו, כלומר מסך mutagenesis insertional ⁵¹ ו RNA השיטתית הפרעה מבוססת מציאת גן מסך ^{52, 53.}

דימות פלואורסצנטי חיה עם widefield, confocal או מיקרוסקופ מבוסס גיליון אור (LSFM) מאפשרת לבחון את המורפולוגיה העוברית של Tribolium כפונקציה של זמן (כלומר morphogenesis) בהקשר רב-ממדים (לוח 1). בשנת widefield הקרינה confocal מיקרוסקופ, את Excitאור ation והפליטה מונחה דרך העדשה האובייקטיבית. בשתי הגישות, הדגימה כולו מוארת לכל מטוס דו ממדי רשם. לפיכך, הדגימות חשופות לרמות אנרגיה גבוהות מאוד. בשנת LSFM, רק fluorophores במישור המוקד נרגש בשל ביטול צימוד של תאורה וזיהוי באמצעות שתי עדשות אובייקטיביות סודר בניצב (איור 1). LSFM מגיע בשני מימושים הקאנוני – למיקרוסקופ תאורת המטוס הבודד (SPIM) ואור הליזר הדיגיטלי סרוק מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס הגיליון (DSLM, איור 2) – ומציע מספר יתרונות מכריעים על פני גישות מסורתיות: (i) יכולת חתך אופטית פנימית, (ii) רזולוציה צירית טוב, (iii) ברמה מופחתת מאוד של הלבנת צילום, (iv) צילום רעילות נמוכה מאוד, (נ) יחס אות לרעש גבוה, (vi) מהירות רכישה גבוהה יחסית, (vii) הדמיה לאורך כיוונים מרובים (viii) חדיר לרקמות עמוקות יותר בשל השימוש של עדשות אובייקטיביות תאורת מספרי צמצם נמוכה ^{54, 55, 56.}

LSFM כבר יושם בהצלחת Tribolium לתעד כמעט המורפוגנזה העוברי כולו ⁵⁷ ו לנתח את העקרונות של קרע קרום חוץ עוברי בתחילת גב סגר ^23. כדי להעלות את האטרקטיביות של LSFM בקהילת Tribolium ועבור מדע חרקים בכלל, זה הוא בעל חשיבות רבה להקמת נהלי עבודה ועל מנת לשפר את השיטות, פרוטוקולים בברכה של משאבים לרמה שבה מיקרוסקופ הופך קל -השתמש כלי סטנדרטי במעבדות הביולוגיה ההתפתחותית, ואת השאלות ביולוגי להישאר במרכז תשומת הלב.

פרוטוקול זה מתחיל עם יסודות של Tribolium </ em> טיפוח, תחזוקה כלומר, רבייה ואיסוף עובר. הבא, שתי אסטרטגיות ניסיוני מומחשות: (i) הדמית חיה של קווים מהונדסים מחוייט (ii) הדמיה של עוברים קבועים כי הוכתמו צבעי ניאון (לוח 2). כתוצאה מכך, שלוש טכניקות הרכבה עם מטרות שונות מעט מוסברים בפירוט (איור 3 ולוח 3): (i) בעמודה agarose, (ii) בחצי הכדור agarose ו (iii) בעל קורי עכביש הרומן. הפרוטוקול ואז מסביר את הליך רכישת נתונים עם LSFM. שיטות הדמיה ושיקולים מרכזיים מתוארות. לבסוף, חזר עובר מוסבר והצעות לעיבוד נתונים בסיסיים מסופקות. בתוצאות הנציג, נתוני הדמיה חיים משני רומן מחוייט הקווים המהונדסים ^{58-כחולת} גליה מוצגים ואת מערכי נתוני הדמית בהתאמה ניתנים כמשאב להורדה. בנוסף, תמונהנתונים של עוברים קבועים כי הוכתמו במגוון צבעי קרינה מוצגים. הדיון מתמקד בקרת איכות, מגבלות נוכחיות של גישת ההדמיה חי ואת ההסתגלות של פרוטוקול מינים אחרים.

הפרוטוקול נכתב עבור מיקרוסקופים פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון המצוידות בתא מדגם מנגנון מהדק rotatable עבור מחזיקי מדגם סטנדרטיים ^{54, 59, 60,} שהן בדרך כלל אלמנטים בצורת גליל עשויים מתכת, פלסטיק או זכוכית בקוטר בטווח המילימטר. הפרוטוקול מתאים גם הוא מימושים הקאנוני, כלומר SPIM ו DSLM, כמו גם עבור setups עם לפחות שתי זרועות תאורה וזיהוי ^{61, 62, 63.} התוצאות נציג להראות נתונים בשני ערוצי ספקטרלי, ירוק (illumination עם לייזר 488 ננומטר, זיהוי באמצעות 525/50 bandpass מסנן) ואדום (תאורה עם לייזר 561 ננומטר, זיהוי באמצעות 607/70 bandpass מסנן), אבל הפרוטוקול ניתן להרחיב לערוצים ספקטרלי שלוש או ארבע.

Protocol

בעלי 1. של תרבויות Tribolium הערה: תנאים סטנדרטיים מוגדרים טמפרטורת דגירה של 25 מעלות צלזיוס ו 70% לחות יחסית בתוך 12 h בהיר / 12 h מחזור כהה. לקבלת מידע נוסף על בעלי Tribolium, הנחיות מתאימות זמינות 64. פרוטוקול זה דורש שנייה ב…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר מסגרת ניסיונית עבור דימות פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתם עובר Tribolium עם LSFM. בשל הרמות הנמוכות של הלבנת תמונה-רעילות צילום, תוצאה ישירה של יכולת החתך האופטית שלה, LSFM הוא גם מתאים במיוחד עבור הדמית חיה ארוך טווח. <p class="jove_content" fo…

Discussion

בקרת איכות

מבחני הדמיה חיים, הליך כנת הקלטה חייב להיות בלתי-פולשנית, כלומר לא את הטיפול המכאני וכימי (האוסף, dechorionation, הרכבה על בעל המדגם) ולא את עומס האנרגיה המשולב במהלך התצפית צריך לפגוע בכדאיויות של הדגימה. עבור מח…

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive