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Biologia dello sviluppo

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em> Tribolium castaneum</em> 배아

Published: April 28, 2017
doi:
10.3791/55629
, ,
1Physical Biology,Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt,Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

Abstract

붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum 발달 유전학 진화 발생 생물학에서 중요한 곤충 모델 생물이되었다. 광 시트 계 형광 현미경 Tribolium 태아의 관찰은 통상 위드와 공 초점 형광 현미경을 통해 여러 장점을 갖는다. 인해 광 시트 기반 현미경의 고유 특성에 살아있는 검체의 3 개 차원 이미지는 높은 신호대 잡음비로 기록 될 수 있고 상당히 여러 지속 기간 동안 광 탈색뿐만 아니라, 다 방향을 따라 광 독성 감소 일. 방법론 개발 및 지속적인 데이터 증가의 4 년 이상으로, 시간은 Tribolium 지역 사회에서 빛 시트 기술의 사용에 대한뿐만 아니라 곤충 사회에서 큰에서 표준 운영 절차를 수립하는 것이 적절 보인다. 이 프로토콜은 F 적합한 세 실장 기술을 설명또는 다른 목적은, 장기 라이브 영상에 적합한 두 개의 새로운 맞춤형 유전자 변형 Tribolium 라인을 제시 고정 배아의 세포 내 구조 레이블을 다섯 형광 염료를 제안하며, 기록 된 데이터의 적절한 평가를위한 데이터 후 처리에 대한 정보를 제공합니다. 대표 결과 장기 라이브 영상 광학 절편 복수 방향을 따라 동일한 태아의 관찰에 집중한다. 각 데이터 세트는 다운로드 가능한 자원으로 제공된다. 마지막으로, 프로토콜은 라이브 영상 분석, 전류 제한 및 다른 곤충 종에 설명 된 절차의 적용을위한 품질 관리에 대해 설명합니다.

이 프로토콜은 주로 표준 실험실 장비를 능가 이미징 솔루션을 추구 발달 생물 학자를위한 것입니다. 그것은 개발하고 마이크로을 수정 기술적으로 지향 실험실 / 지역 사회 사이의 격차를하기 위해 지속적인 시도를 촉진방법 론적으로 복사 및 기술 문제에 '플러그 앤 플레이'솔루션을 필요로 생명 과학 연구소 / 사회. 또한, 관심의 중심에 생물학적 질문을 움직이는 공리 접근 방식을 지원합니다.

Introduction

어둠 속에의 딱정벌레의 대가족 (Tenebrionidae)에 속하는 붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum는 농업 및 생명 과학에서 오랜 역사를 가지고와 과일에 이어 두 번째로 최고의 연구 모델 곤충 모델 생물은 노랑 초파리 비행입니다. 지난 사십 년 동안, 여러 가지 이유로 배아 형태 형성에서, 지난 20 년 동안, 진화 발생 생물학의 발달 유전학 강력하고 인기있는 곤충 모델 생물되었고 :

초파리와 Tribolium 모두는 Holometabola에 속하지만, 약 300 만 년 전 1, 2, 3, 4 분기. 높은 파생 초파리의 배아 발달이 일반적으로 생각하는 동안, Tribolium는 (STABLE)보다 조상 모드를 보여줍니다곤충 종 5, 6, 7, 8, 9의 상당히 큰 비율로 발견 클럽 봉사. 그 구기 및 안테나는 배아 10, 11, 12, 13, 14, 15 중 이미 출현 즉 첫째 Tribolium는 비 involuted 헤드 현상을 나타낸다. 둘째, Tribolium는 짧은 배아 발달, 즉 복부 세그먼트 germband 신도는 16, 17, 18, 19 중 후방 성장 구역으로부터 순차적으로 추가의 원리를 따른다. 셋째, Tribolium 개발하고 나중에 저하두 개의 별도의 배아 멤브레인은 복부를 커버 배아 양막, 완전히 20, 21, 22 배를 감싸고 장막을 즉. 두 막은 중요한 형태 발생 (23)뿐만 아니라 미생물 24, 25 및 탈수 (26)에 대한 보호 역할을한다. 넷째는 embryonically 개발 다리는 애벌레 삶의 단계에서 완벽하게 작동하며, 번데기 변태 27, 28, 29, 30, 31 중 성인 다리의 primordia 역할을합니다.

때문에 작은 크기와 겸손한 요구에, 실험실에서 Tribolium의 재배는 매우 간단합니다. 야생형의 문화 (WT) 균주 또는 형질 전환 라인들은 전형적으로 약 100-300 성인 구성 및 전체 그레인 밀 구성 성장 배지 서너 센티미터 (약 50g 충전 한 리터 유리 병 (발자국 80cm 2)) 내에서 유지 될 수있다 밀가루는 비활성 건조 효모와 보충. 물 공급이 필요하지 않습니다. 이 소형 또는 중간 크기 상업적으로 이용 가능한 곤충 인큐베이터 내에서 딱정벌레 문화의 수십 유지하기 위해 아주 작은 실험실을 할 수 있습니다. Tribolium 이후 발달 단계 (유충 후 약 네번째 령, 번데기 어른) 쉽게 체질하여 성장 배지로부터 분리된다. 동기화 배아 알을 낳는 매체 단기간 성인 배양함으로써 얻어진다. 재고 유지는 일반적으로 22 ~ 25 ℃에서 수행되는 동안 급속한 발전을 위해, 딱정벌레 문화가 32 ° C (세대 당 약 4 주)에 보관 (약 십주 세대 당).

지난 십 년간 내에서, 많은 표준 절반신흥 모델 생물 책 (32)에 요약 된 바와 같이 hniques 점차 적응 Tribolium 위해 최적화되었다. 매우 중요한 배아 (33) 유전 적 방법, 유충 34, 35 또는 부모 36, 37 RNA 간섭 기반 유전자 녹다운, 어느 피기 38, 39 또는 미노스 40 트랜스 장치 및 CRISPR / Cas9 기반 게놈 생식선 변환 전진 엔지니어링 41. 또한, Tribolium 게놈은 10 년 전의 42 내지 약 서열화되었으며, 효율적인 게놈 전체의 식별 및 유전자 44 체계적 분석이 가능 조립체 (43)를 해제 게놈 번째 라운드에서 지금 </s업> 또는 기타 유전 적 요소 (45), (46). 또한, 다른 네 coleopteran 종의 게놈 비교 유전자 접근법 47, 48, 49, 50 가능하다. 게놈 시퀀싱에 대응하여 두 개의 대규모 유전자 분석은 삽입 성 돌연변이 유발의 스크린 (51) 및 체계적 RNA 간섭 기반 유전자 녹다운 화면 (52), (53), 즉, 실행되었다.

위드, 촛점 또는 광 시트 기반 현미경 (LSFM)와 형광 라이브 영상 다차원 컨텍스트 (표 1)에서 시간의 함수 (즉, 형태 형성)로서 Tribolium 배아의 형태를 관찰 할 수있다. 위드와 공 초점 형광 현미경에서, excitATION과 출사 광은 동일한 대물 렌즈를 통해 안내된다. 두 접근법에서, 전체 시료마다 기록 된 2 차원 평면에 대해 조사된다. 따라서, 표본은 매우 높은 에너지 레벨을 실시한다. LSFM에서, 초점면에서 단지 형광 인해 두 개의 수직 배열 대물 렌즈 (도 1)를 이용하여 조명 및 검출 디커플링 기쁘게. 단일 평면 조명 현미경 (SPIM)와 디지털 스캔 레이저 광 시트 기반의 형광 현미경 (DSLM, 그림 2) – – LSFM 두 규범적인 구현으로 제공하고 기존의 방법에 비해 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다 : (I) 고유의 광학 절편 기능, (ⅱ) 좋은 축 해상도, (Ⅲ) 광 표백 강하게 감소 레벨 (IV)의 매우 낮은 광 독성, (V)이 높은 신호대 잡음비 (VI)의 비교적 높은 수집 속도 (VII) 이미징 여러 방향 및 (VI 함께낮아서 개구 조사 대물 렌즈 (54), (55), (56)의 사용과 ⅱ) 깊은 조직 침투.

LSFM 이미 성공적으로 거의 전체 배아 형태 형성 57을 기록하고 지느러미 폐쇄 (23)의 시작 부분에 여분의 배아 막 파열의 원칙을 분석 Tribolium에 적용되었습니다. 현미경은 편의성 될 곳은 표준 운영 절차를 수립하고, 방법, 프로토콜과 수준으로 자원의 풀을 개선하기 위해 매우 중요하다의 Tribolium 지역 사회와 일반 곤충 과학에 대한 LSFM의 매력을 높이려면 발달 생물학 실험실에서 표준 도구를 -USE, 생물학적 질문 관심의 중심에있어.

이 프로토콜은 Tribolium의 기초 <시작/ EM> 재배, 즉 유지 보수, 복제 및 배아 수집. 다음으로, 두 실험 전략들이 도시되어있다 : (I) 라이브 주문품 제닉 라인 화상 및 형광 염료 (표 2)으로 염색 하였다 고정 배아 (II) 촬상. (I) 아가로 오스 컬럼 (II) 아가 반구 및 (iii) 신규 거미줄 보유자 :이어서, 약간 다른 목적 세 실장 기술 상세 (도 3 및 표 3)에 설명되어있다. 이 프로토콜은 다음 LSFM와 데이터 수집 절차를 설명합니다. 이미징 양식 및 주요 고려 사항이 설명되어 있습니다. 마지막으로, 배아 검색 설명한다 기본 데이터 처리를위한 제안을 제공한다. 대표적인 결과, 라이브 영상 데이터 개의 신규 주문 제작 및 글 리아 블루 58 개 트랜스 제닉 라인이 도시되어 있고, 각 촬상 데이터 세트는 다운로드 가능한 자원으로 제공된다. 또한, 이미지형광 염료의 다양한 염색 고정 배아의 데이터가 표시된다. 토론은 품질 관리, 라이브 이미징 방식의 전류 제한 및 다른 종의 프로토콜의 적응에 초점을 맞추고 있습니다.

프로토콜은 샘플 챔버 통상적 직경 금속, 플라스틱 또는 유리로 만들어진 원통형 요소 표준 시료 홀더 (54), (59), (60)에 대해 회전 가능한 클램프기구가 장착되어 광 시트 계 형광 현미경 작성된 밀리미터 범위이다. 이 프로토콜은 두 규범적인 구현 예 및 SPIM DSLM뿐만 아니라 둘 이상의 조명 및 검출 아암 (61) (62) (63)에 대한 설정에 적합하다. 대표적인 결과는 두 채널의 스펙트럼 데이터를 표시, 녹색 (IL488 nm의 레이저 검출 관통 필터 대역 통과 70분의 607 관통 필터)와 레드 (a 561 nm의 레이저로 조명 검출 대역 통과 50분의 525)하지만, 프로토콜 lumination 서너 스펙트럼 채널로 확장 될 수있다.

Protocol

Tribolium 문화의 1. 축산 주 : 표준 조건 / 12 시간 다크 사이클 밝은 12 시간에서 25 ° C 및 상대 습도 70 %의 항온 처리 온도로 정의된다. Tribolium 사육에 대한 자세한 내용은 각각의 가이드 라인은 64 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 kg의 양으로 제조하고 몇 달 동안 저장 될 수있는 두 개의 서로 다른 밀가루 기반 미디어가 필요합니다. 이?…

Representative Results

이 프로토콜은 생활의 형광 이미징 또는 LSFM와 고정 및 스테인드 Tribolium 배아에 대한 실험 프레임 워크를 설명합니다. 인해 광 표백 광 독성, 그 단면 광학 성능의 직접적인 결과의 낮은 수준으로, LSFM 장기 라이브 영상에 특히 적합하다. 신규 AGOC {} mEmerald ATub'H2B-1 형질 전환 라인은 알파 – 튜 불린 1 촉진제 <sup …

Discussion

품질 관리

라이브 영상 분석에서, 준비 및 녹음 과정은 기계적 및 화학적 처리 (샘플 홀더에 장착 수집, dechorionation)도 관찰 기간 동안 집단 에너지 부하도, 즉 표본의 생존에 영향을해야, 비 침습적해야합니다. WT 개발의 특성을 연구 들어, 배아가 성공적으로 검색되고, 녹음 과정을 생존하고 건강한 성인으로 발전하는 실험에서만 사용 데이터를 권장합니?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 기술 지원 스벤 플래스합니다. 글 리아 – 블루 형질 전환 라인은 그레고르 버처 (괴팅겐, 독일)에서 일종의 선물이었다. 이 연구는 괴테의 Buchmann 분자 생명 과학 연구소 (BMLS, 감독 엔리코 슐레이프)에서 EHKS 부분적으로 부여 Macromolecular의 단지 (CEF-MC, EXC (115), 스피커 폴커 도이치)에 대한 암마 우수 프랑크푸르트의 클러스터에 의해 투자되었다 Universität 프랑크푸르트 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 홈페이지입니다.

Materials

full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 ml B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive
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Riferimenti

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Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).
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