Lys Sheet-basert Fluorescensmikroskopi of Living eller fikseres og farges<em> Tribolium castaneum</em> Embryoet

Summary

Avbilde morfogenesen av insekt embryoer med lys ark-baserte fluorescens mikroskopi har blitt state of the art. Denne protokollen skisserer og sammenligner tre monterings teknikker som passer for Tribolium castaneum embryoer, introduserer to nye spesiallagde transgene linjer godt egnet for direkte avbildning, diskuterer vesentlige kvalitetskontroller og viser nåværende eksperimentelle begrensninger.

Abstract

Den røde mel bille Tribolium castaneum har blitt en viktig insekt modellorganisme i utviklings genetikk og evolusjonær utviklingsbiologi. Observasjonen av Tribolium embryoer med lys ark-baserte fluorescens mikroskopi har flere fordeler fremfor konvensjonelle vidfelt og konfokal fluorescens mikroskopi. På grunn av de unike egenskapene til en lett platebasert mikroskop, kan tredimensjonale bilder av levende eksemplarer tas opp med høye signal-til-støy-forhold og betydelig redusert foto-bleking, så vel som fototoksisitet langs flere retninger over perioder som varer flere dager. Med mer enn fire år med metodeutvikling og en kontinuerlig økning av data, synes tiden hensiktsmessig å etablere standard driftsprosedyrer for bruk av lys ark teknologi i Tribolium samfunnet så vel som i insektet samfunnet for øvrig. Denne protokollen beskriver tre monteringsteknikker som er egnet feller ulike formål, presenterer to nye spesiallagde transgene linjer Tribolium egnet for langvarig direkte avbildning, antyder fem fluorescerende fargestoffer å merke intracellulære strukturer av faste embryoer og gir informasjon om dataetterbehandling for rettidig evaluering av de registrerte data. Representative resultater konsentrere seg om langtids direkte avbildning, optisk seksjonering og observasjon av den samme embryoet langs flere retninger. De respektive datasettene blir tilveiebragt som et nedlastbart ressurs. Endelig omhandler den protokoll kvalitetskontroller for levende billeddannende analyser, nåværende begrensninger og anvendeligheten av de skisserte fremgangsmåter til andre insektarter.

Denne protokollen er primært beregnet for utviklings biologer som søker bildeløsninger som overgår standard laboratorieutstyr. Det fremmer den kontinuerlige forsøk på å lukke gapet mellom de teknisk orientert laboratorier / samfunn, som utvikler og raffinere mikrokopiere metodisk, og life science laboratorier / lokalsamfunn, som krever 'plug-and-play' løsninger på tekniske utfordringer. Videre støtter det et aksiomatisk tilnærming som beveger de biologiske spørsmålene i sentrum for oppmerksomheten.

Introduction

Den røde mel bille Tribolium castaneum, som tilhører den store familien av Darkling biller (Tenebrionidae), har en lang historie innenfor landbruket og biovitenskap, og er den nest beste studerte modellen insekt modellorganisme etter bananflue Drosophila melanogaster. I løpet av de siste fire tiår, ble det et kraftig og populært insekt modellorganisme i utviklingsgenetikk, i evolusjonær utviklingsbiologi, og i løpet av de siste tjue årene, i embryonale morphogenesis for en rekke årsaker:

Drosophila og Tribolium begge tilhører Holometabola, men splittet omtrent 300 millioner år siden ^{1, 2, 3, 4.} Mens den embryoutvikling av Drosophila blir vanligvis betraktet som høyt avledet viser Tribolium en mer anen måte utviklling som er funnet i en betydelig større andel av insektarter ^{5, 6, 7, 8, 9.} For det første oppviser Tribolium ikke-involusjon hode utvikling, det vil si dens munn og antenner oppstår allerede i løpet av embryogenesen ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Dernest følger Tribolium prinsippene for kort-bakterie utvikling, det vil si mage segmenter legges sekvensielt fra en bakre vekst sone under germband forlengelse ^{16, 17, 18, 19.} For det tredje, utvikler Tribolium og senere degraderesto ekstra-embryonale membraner dvs. amnion, som dekker embryo bare ventrally, og serosa, som omslutter fosteret helt ^{20, 21, 22.} Begge membraner spille en avgjørende morfogenetisk ^23, så vel som beskyttende rolle mot mikroorganismer ^{24, 25} og ²⁶ uttørking. For det fjerde, de embryonically utviklings beina er fullt funksjonell under larve livsfase og tjene som primordia for voksne bena under pupal metamorfose ^{27, 28, 29, 30, 31.}

På grunn av sin lille størrelse og beskjedne krav, dyrking av Tribolium i laboratoriet er ganske grei. Kulturer av villtype (WT) stammer eller transgene linjer vil typisk bestå av rundt 100 til 300 voksne og kan holdes innenfor en-liters glassflasker (footprint 80 ^cm2) fylt tre til fire centimeter høye (ca. 50 g) med vekstmedium som består av hel hvete mel supplert med inaktive tørrgjær. En vanntilførsel er ikke nødvendig. Dette gjør at selv små laboratorier for å holde dusinvis av bille kulturer innen små- eller mellomstore kommersielt tilgjengelige insekt inkubatorer. Senere utviklingsstadier av Tribolium (larver etter omtrent fjerde stadium, puppe og voksne) er lett skilles fra vekstmediet ved sikting. Synkroniserte embryoer blir oppnådd ved å inkubere voksne for korte perioder på egg-leggende medium. For rask utvikling, blir bille kulturene holdt ved 32 ° C (ca. fire uker per generasjon), mens lagerholdet blir typisk utført ved 22-25 ° C (omtrent ti uker pr generasjon).

Innenfor det siste tiåret, mange standard techniques er blitt tilpasset gradvis og optimalisert for Tribolium, som oppsummert i vekstmodellorganismer bøker ^32. Av stor betydning er avanserte genetiske fremgangsmåter så som embryonal ^33, larve- ^{34, 35} eller foreldre ^{36, 37} RNA interferens-baserte gen knockdown, kimlinje transformasjon med enten piggyBac ^{38, 39} eller den Minos ⁴⁰ transposase system og CRISPR / Cas9-baserte genom ingeniør ^41. Videre er Tribolium genomet blitt sekvensert omtrent ti år siden ^42, og er nå i den tredje runden av genomet sammenstillingen frigjøre ^43, som tillater effektiv og genom-bred identifikasjon og systematisk analyse av gener ⁴⁴ </sopp> eller andre genetiske elementer ^{45, 46.} I tillegg genomene til fire andre billearter er tilgjengelige for sammenlignings genetiske tilnærminger ^{47, 48, 49, 50.} I forbindelse med det sekvenserte genomet, har to store genetiske analyser er utført, det vil si en innskuddsmutagenese skjerm ⁵¹ og en systematisk RNA interferens-baserte gen knockdown skjerm ^{52, 53.}

Fluorescens direkte avbildning med Vidfelt, konfokalt eller lys platebasert mikroskopi (LSFM) gjør det mulig å observere den embryoniske morfologien til Tribolium som en funksjon av tid (dvs. morphogenesis) i en flerdimensjonal sammenheng (tabell 1). I Vidfelt og konfokal fluorescens mikroskopi, den Excitasjon og emisjon lys blir ledet gjennom den samme objektivlinsen. I begge tilnærminger, er hele prøven opplyst for hver registrert todimensjonalt plan. Derfor blir prøvene utsettes for meget høyt energinivå. I LSFM, bare fluoroforene i fokalplanet er spent på grunn av frakobling av belysning og deteksjon ved hjelp av to perpendikulært anordnede objektivlinser (figur 1). LSFM kommer i to canonic implementeringer – den eneste plan belysning mikroskop (SPIM) og det digitale skannede laserlys platebasert fluorescens mikroskop (DSLM, figur 2) – og gir flere viktige fordeler i forhold til tradisjonelle fremgangsmåter: (i) indre optisk seksjonering evne, (ii) god aksiell oppløsning, (iii) sterkt redusert nivå av foto-bleking, (iv) svært lav bilde-toksisitet, (v) høyt signal-til-støy-forhold, (vi) relativt høye anskaffelses hastighet, (vii) avbildning langs flere retninger, og (ivii) dypere vev penetrering på grunn av bruken av lave numeriske apertur belysningsobjektivlinser ^{54, 55, 56.}

LSFM har allerede blitt brukt i Tribolium å dokumentere nesten hele den embryoniske morphogenesis ⁵⁷ og for å analysere prinsippene for ekstra-embryonale membranen briste ved begynnelsen av dorsal lokket ^23. For å heve attraktivitet LSFM i Tribolium samfunnet og for insekt vitenskap generelt, er det av stor betydning å etablere standard operasjonsprosedyrer og forbedre metoder, protokoller og pool av ressurser til et nivå hvor mikroskop blir en ease-of -Bruke standard verktøy i utviklingsbiologi laboratorier, og de biologiske spørsmål bo i sentrum for oppmerksomheten.

Denne protokollen begynner med det grunnleggende Tribolium </ em> dyrking, dvs. vedlikehold, reproduksjon og embryo samlingen. Deretter ble to eksperimentelle strategier vist nedenfor: (i) levende avbildning av skreddersydde transgene linjer og (ii) bildedannelse av faste embryoer som var farget med fluorescerende fargestoffer (tabell 2). Deretter blir tre monteringsteknikker med litt forskjellige formål forklart i detalj (Figur 3 og Tabell 3): (i) agarose kolonne, (ii) den agarose halvkule og (iii) den nye spindelvev holderen. Protokollen forklarer deretter datainnhentingsprosedyre med LSFM. Bildediagnostikk og viktige hensyn er skissert. Til slutt blir embryo gjenfinning forklart og forslag til basisdatabehandlings er gitt. I de representative resultater, direkte avbildning av data fra to nye skreddersydd og glia-blå ⁵⁸ transgene linjer er vist og de respektive avbildningsdatasett er tilveiebragt som et nedlastbart ressurs. I tillegg imagedata for faste embryoer som var farget med en rekke av fluorescens-fargestoffer er angitt. Diskusjonen fokuserer på kvalitetskontroll, aktuelle begrensningene ved direkte avbildning tilnærming og tilpasning av protokollen til andre arter.

Protokollen er skrevet for å lette ark-baserte fluorescensmikroskoper som er utstyrt med et prøvekammer og en roterbar klemmeinnretning for standardiserte prøveholdere ^{54, 59, 60,} som er typisk sylinderformede elementer fremstilt av metall, plast eller glass med en diameter i millimeterområdet. Protokollen er også egnet for både canonic implementeringer, dvs. SPIM og DSLM, så vel som for oppsett med to eller flere belysnings og deteksjonsarmene ^{61, 62, 63.} De representative resultater viser data i to spektrale kanaler, grønn (illumination med en 488 nm laser, deteksjon gjennom et båndpassfilter 525/50) og rød (belysning med en 561 nm laser, deteksjon gjennom et båndpassfilter 607/70), men protokollen kan utvides til tre eller fire spektralkanaler.

Protocol

1. Husbandry av Tribolium kulturer MERK: Standard betingelser er definert som en inkubasjonstemperatur på 25 ° C og 70% relativ fuktighet i en 12 timers lys / 12 timers mørk syklus. For mer informasjon om Tribolium reindrift, respektive retningslinjer er tilgjengelige 64. Denne protokollen krever to forskjellige mel baserte medier, som kan fremstilles i kilogrammengder, og som er lagret i flere måneder. Før arbeid med mel og inaktive …

Representative Results

Denne protokollen beskriver en eksperimentell rammeverk for fluorescensavbildning av levende eller fiksert og farget Tribolium embryoer med LSFM. På grunn av de lave nivåer av foto-bleking og fototoksisitet, en direkte konsekvens av den optiske snitting evne, er LSFM spesielt godt egnet for langvarig direkte avbildning. Den nye AGOC {ATub'H2B-mEmerald} 1 transgen linje uttrykker en histone2B-mEmerald fusjonsprot…

Discussion

Kvalitetskontroll

I levende billeddannende analyser, må preparatet og opptaksprosedyren være ikke-invasiv, dvs. verken den mekaniske og kjemiske håndtering (samling, dechorionation, montering på prøveholderen) og heller ikke den integrerte energi belastning i løpet av observasjons skal påvirke levedyktigheten til prøvestykket. For studier som karakteriserer WT utvikling, anbefales det å kun bruke data fra eksperimenter der embryoet overlever innspillingspro…

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive