Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em> Tribolium castaneum</em> Los embriones

Summary

Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Abstract

El escarabajo rojo de la harina Tribolium castaneum se ha convertido en un importante organismo modelo de insectos en la genética del desarrollo y la biología del desarrollo evolutivo. La observación de embriones Tribolium con microscopía de fluorescencia basada en la lámina de luz tiene múltiples ventajas sobre widefield convencional y microscopía de fluorescencia confocal. Debido a las propiedades únicas de un microscopio a base de lámina de luz, imágenes en tres dimensiones de los especímenes vivos se pueden grabar con altas relaciones de señal a ruido y redujeron significativamente foto-blanqueo, así como foto-toxicidad a lo largo de múltiples direcciones durante períodos que duran varios días. Con más de cuatro años de desarrollo metodológico y un aumento continuo de datos, el tiempo parece conveniente establecer procedimientos operativos estándar para el uso de la tecnología de lámina de luz en la comunidad Tribolium, así como en la comunidad de insectos en general. Este protocolo describe tres técnicas de montaje adecuadas fo diferentes propósitos, presenta dos nuevas líneas Tribolium transgénicos medida apropiada para imágenes en vivo a largo plazo, sugiere cinco colorantes fluorescentes para etiquetar las estructuras intracelulares de embriones fijos y proporciona información acerca de post-procesamiento de datos para la evaluación oportuna de los datos registrados. Los resultados representativos se concentran en imágenes en vivo a largo plazo, seccionamiento óptico y la observación del mismo embrión a lo largo de múltiples direcciones. Los respectivos conjuntos de datos se proporcionan como un recurso descargable. Por último, el protocolo analiza los controles de calidad para los ensayos de formación de imágenes en vivo, las limitaciones actuales y la aplicabilidad de los procedimientos que se indican a otras especies de insectos.

Este protocolo está destinado principalmente a los biólogos del desarrollo que buscan soluciones de imágenes que superan a equipo de laboratorio estándar. Promueve el intento continuo para cerrar la brecha entre los laboratorios / comunidades técnicamente orientada, que se desarrollan y refinan microscopiar metodológicamente, y los laboratorios de ciencias de la vida / comunidades, que requieren soluciones 'plug-and-play' a los desafíos técnicos. Además, es compatible con un enfoque axiomático que mueve las cuestiones biológicas en el centro de atención.

Introduction

El escarabajo de la harina Tribolium castaneum rojo, que pertenece a la gran familia de escarabajos negros (Tenebrionidae), tiene una larga historia dentro de las ciencias agrícolas y de la vida y es el organismo modelo modelo de insectos segunda mejor estudiado después de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Durante las últimas cuatro décadas, se convirtió en un poderoso y popular organismo modelo en la genética del desarrollo de insectos, en la biología del desarrollo evolutivo y, durante los últimos veinte años, en la morfogénesis embrionaria para una variedad de razones:

Drosophila y Tribolium ambos pertenecen a la Holometabola, pero se separaron hace aproximadamente 300 millones de años ^{1, 2, 3, 4.} Mientras que el desarrollo embrionario de Drosophila se considera comúnmente como altamente derivada, Tribolium muestra un modo más ancestral de develrrollo que se encuentra en una proporción considerablemente mayor de especies de insectos ^{5, 6, 7, 8, 9.} En primer lugar, Tribolium exhibe desarrollo de la cabeza no involutiva, es decir, sus partes de la boca y las antenas ya surgen durante la embriogénesis ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} En segundo lugar, Tribolium sigue los principios de desarrollo a corto germen, es decir, segmentos abdominales se añaden secuencialmente a partir de una zona de crecimiento posterior durante la elongación germband ^{16, 17, 18, 19.} En tercer lugar, Tribolium desarrolla y se degrada más tardedos membranas extraembrionarias es decir, el amnios, que cubre el embrión solamente ventralmente, y la serosa, que envuelve el embrión completamente ^{20, 21, 22.} Ambas membranas juegan un morfogenética fundamental ²³ así como la función de protección contra los microorganismos ^{24, 25} y la desecación ^26. En cuarto lugar, las piernas embrionaria en desarrollo son totalmente funcionales durante la etapa de la vida de las larvas y sirven como los primordios de las piernas de adultos durante la metamorfosis de pupa ^{27, 28, 29, 30, 31.}

Debido a su tamaño y modestos pequeñas demandas, el cultivo de Tribolium en el laboratorio es bastante sencillo. Los cultivos de tipo salvaje (WT) cepas o líneas transgénicas consisten típicamente de alrededor de 100-300 adultos y puede mantenerse dentro de botellas de un litro de vidrio (la huella de 80 cm ²⁾ lleno de tres a cuatro centímetros de alto (aproximadamente 50 g) con medio de crecimiento que consiste en trigo de grano completo harina suplementado con levadura seca inactiva. Un suministro de agua no es necesario. Esto permite que incluso pequeños laboratorios para mantener docenas de culturas escarabajo dentro de incubadoras de insectos comercialmente disponibles pequeñas o medianas. Etapas de desarrollo posteriores de Tribolium (larvas después de aproximadamente el cuarto instar, pupas y adultos) se separan fácilmente del medio de crecimiento por tamizado. embriones sincronizados se obtienen mediante la incubación de los adultos, por períodos cortos en medio de puesta de huevos. Para el desarrollo rápido, culturas escarabajo se mantienen a 32 ° C (alrededor de cuatro semanas por generación), mientras se mantiene de stock se realiza típicamente a 22-25 ° C (aproximadamente diez semanas por generación).

En la última década, muchos tec normahniques se han ido adaptando y optimizado para Tribolium, que se resumen en los libros Emergentes organismos modelo ^32. De gran importancia son avanzados métodos genéticos tales como embrionario ^33, larval ^{34, 35} o parental ^{36, 37} de ARN basado en la interferencia desmontables gen, la transformación de la línea germinal, ya sea con la piggyBac ^{38, 39} o el sistema de transposasa de Minos ⁴⁰ y CRISPR / genoma basado en Cas9 ingeniería ^41. Además, el genoma Tribolium ha sido secuenciado hace aproximadamente una década ^42, y ahora está en la tercera ronda del genoma conjunto de liberación ^43, que permite la identificación eficiente y de todo el genoma y el análisis sistemático de los genes ⁴⁴ </sarriba> u otros elementos genéticos ^{45, 46.} Además, los genomas de otras cuatro especies de coleópteros están disponibles para los enfoques genéticos comparativos ^{47, 48, 49, 50.} En asociación con el genoma secuenciado, dos análisis genéticos a gran escala se han realizado, es decir, una pantalla de mutagénesis de inserción ⁵¹ y una pantalla gen desmontables basado en la interferencia de ARN sistemática ^{52, 53.}

Fluorescencia de imágenes en vivo con campo amplio, confocal o microscopía basada en la lámina de luz (LSFM) permite observar la morfología embrionaria de Tribolium como una función del tiempo (es decir, la morfogénesis) en un contexto multi-dimensional (Tabla 1). En campo amplio y fluorescencia confocal de microscopía, la Excitación y la emisión de luz se guía a través de la misma lente objetivo. En ambos enfoques, la muestra entera se ilumina para cada plano de dos dimensiones grabado. Por lo tanto, las muestras se someten a niveles muy altos de energía. En LSFM, sólo los fluoróforos en el plano focal se excitan debido a un desacoplamiento de la iluminación y la detección mediante el uso de dos lentes de objetivo perpendicularmente dispuestas (Figura 1). LSFM viene en dos implementaciones canónicas – el plano único de iluminación de microscopio (SPIM) y el microscopio de fluorescencia basada en la lámina de luz láser escaneado digital (DSLM, la Figura 2) – y ofrece varias ventajas cruciales sobre los enfoques tradicionales: (i) capacidad de seccionamiento óptico intrínseco, (ii) resolución buena axial, (iii) fuertemente reducido nivel de foto-blanqueo, (iv) muy bajo foto-toxicidad, (v) alta relación señal-ruido, (vi) relativamente alta velocidad de adquisición, (vii) de formación de imágenes a lo largo de múltiples direcciones y (viii) la penetración de tejido más profundo debido a la utilización de apertura numérica iluminación baja lentes de objetivo ^{54, 55, 56.}

LSFM ya se ha aplicado con éxito en Tribolium para documentar casi toda la morfogénesis embrionaria ⁵⁷ y para analizar los principios de la ruptura de la membrana extra-embrionario al inicio del cierre dorsal ^23. Para aumentar el atractivo de LSFM en la comunidad Tribolium y para la ciencia de insectos en general, es de gran importancia para establecer procedimientos normalizados de trabajo y para mejorar los métodos, protocolos y el conjunto de recursos a un nivel en el microscopio se convierte en una facilidad de -use herramienta estándar en los laboratorios de biología del desarrollo, y las cuestiones biológicas permanecen en el centro de atención.

Este protocolo comienza con los fundamentos de Tribolium </ em> cultivo, es decir, el mantenimiento, la reproducción y la recolección de los embriones. A continuación, se ilustran dos estrategias experimentales: (i) de formación de imágenes en vivo de las líneas transgénicas a medida y (ii) de formación de imágenes de embriones fijos que se tiñeron con colorantes fluorescentes (Tabla 2). Posteriormente, tres técnicas de montaje con ligeramente diferentes propósitos se explican en detalle (Figura 3 y en la Tabla 3): (i) la columna de agarosa, (ii) el hemisferio agarosa y (iii) el nuevo soporte de tela de araña. El protocolo a continuación se explica el procedimiento de adquisición de datos con LSFM. modalidades de imagen y consideraciones clave se describen. Por último, la recuperación de embriones se explica y se proporcionan sugerencias para el procesamiento de datos básicos. En los resultados representativos, datos de imágenes en vivo de dos novela hechos a medida y se muestran las ⁵⁸ líneas transgénicas Glia-azul y los respectivos conjuntos de datos de formación de imágenes se proporcionan como un recurso descargable. Además, una imagense presentan los datos de los embriones fijos que se tiñeron con una variedad de colorantes fluorescentes. La discusión se centra en el control de calidad, las limitaciones actuales del enfoque de imágenes en vivo y la adaptación del protocolo con otras especies.

El protocolo está escrito para microscopios de fluorescencia basada en la lámina de luz que están equipadas con una cámara de muestra y un mecanismo de abrazadera giratoria para los titulares estandarizados de muestra ^{54, 59, 60,} que son típicamente elementos en forma de cilindro de metal, plástico o vidrio con un diámetro en el rango de milímetros. El protocolo también es adecuado tanto para las implementaciones canónicas, es decir, SPIM y DSLM, así como para configuraciones con dos o más brazos de iluminación y detección ^{61, 62, 63.} Los resultados representativos muestran datos de dos canales espectrales, verde (ILlumination con un láser de 488 nm, la detección a través de un filtro de 525/50 de paso de banda) y rojo (iluminación con un láser de 561 nm, la detección a través de un filtro de 607/70 de paso de banda), pero el protocolo se puede ampliar a tres o cuatro canales espectrales.

Protocol

1. Cría de Tribolium culturas NOTA: Las condiciones estándar se definen como una temperatura de incubación de 25 ° C y 70% de humedad relativa en un 12 h brillantes / 12 h ciclo de oscuridad. Para obtener más información sobre Tribolium cría, las guías respectivas 64 están disponibles. Este protocolo requiere dos medios a base de harina diferentes, que se pueden preparar en cantidades kilogramo y almacenados durante varios meses. …

Representative Results

Este protocolo describe un marco experimental para formación de imágenes de fluorescencia de vida o embriones fijados y teñidos Tribolium con LSFM. Debido a los bajos niveles de foto-blanqueador y foto-toxicidad, una consecuencia directa de su capacidad de seccionamiento óptico, LSFM es particularmente muy adecuado para imágenes en vivo a largo plazo. La novela AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 línea transgénica…

Discussion

Control de calidad

En los ensayos de formación de imágenes en vivo, el procedimiento de preparación y la grabación debe ser no invasivo, es decir, ni la mecánica y manipulación de productos químicos (recogida, dechorionation, de montaje en el soporte de la muestra), ni la carga integrada de energía durante la observación debe afectar a la viabilidad de la muestra. Para los estudios que caracterizan el desarrollo WT, se recomienda el uso de datos sólo a par…

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive