Zebrafish में तीव्र अल्कोहल जिगर की चोट के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल ने zebrafish लार्वा से लिवर के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का वर्णन किया है जो 24 घंटे के लिए 2% इथेनॉल के साथ इलाज किया गया है। यौगिक स्टेटोसिस में इस तरह के गंभीर इथेनॉल उपचार के परिणाम और यकृत वैस्यूलेटर के सूजन।
Abstract
अल्कोहल लीवर रोग (एएलडी) तीव्र या पुरानी शराब दुरुपयोग के कारण जिगर को नुकसान का उल्लेख करता है। यह अल्कोहल से संबंधित रोग और मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक है और संयुक्त राज्य में 2 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करता है। एएलडी के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए शराब से प्रेरित लिवर की चोट के अंतर्गत सेलुलर और आणविक तंत्र की बेहतर समझ महत्वपूर्ण है। Zebrafish लार्वा प्रदर्शन यकृत स्टेटोसिस और fibrogenesis 2% इथेनॉल के लिए जोखिम के सिर्फ 24 घंटे के बाद, उन्हें तीव्र शराबी यकृत की चोट के अध्ययन के लिए उपयोगी बना। यह काम zebrafish लार्वा में तीव्र इथेनॉल के उपचार की प्रक्रिया का वर्णन करता है और यह दर्शाता है कि यह यकृत रक्त वाहिकाओं के स्टेटोसिस और सूजन का कारण बनता है। हेमटॉक्सिलिन और ईसिन (एच एंड ई) धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल जो कि zebrafish लार्वा जिगर के ऊतकीय विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, को भी वर्णित किया गया है। एच एंड ई के धुंधला होने पर immunofluorescence पर कई अनूठे फायदे होते हैं, क्योंकि यह सभी जीवों के निशान हैंएर कोशिकाएं और बाह्य घटकों को एक साथ और आसानी से यकृत चोट, जैसे कि स्टेटोसिस और फाइब्रोसिस का पता लगा सकता है। मॉडलिंग विष और वायरस प्रेरित लीवर की चोट के साथ-साथ विरासत में मिली लीवर रोगों में zebrafish के बढ़ते उपयोग को देखते हुए, यह प्रोटोकॉल इन सभी अध्ययनों में किए गए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है।
Introduction
अल्कोहल लीवर रोग (ALD), जो अल्कोहल अतिसंवेदनशीलता के कारण होता है, अल्कोहल से संबंधित रोग और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। संयुक्त राज्य में, लगभग आधा यकृत रोग की मृत्यु में शराब 1 शामिल है, और ALD लगभग 3 में से 3 यकृत प्रत्यारोपण के लिए जिम्मेदार है। ALD एक व्यापक स्पेक्ट्रम है स्टीटोसिस, जो हेपोटोसाइट्स में अतिरिक्त लिपिड संचय के द्वारा होता है, अत्यधिक पीने के प्रारंभिक चरण में होता है और अल्कोहल के उपयोग की समाप्ति पर प्रतिवर्ती होता है आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव में और शराब का सेवन जारी रखने से, यकृत स्टेटोसिस शराबी हेपेटाइटिस को प्रगति कर सकता है और अंत में, सिरोसिस 3 । कृंतक एएलडी मॉडल का उपयोग करने वाले अध्ययन ने रोग में पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्रदान की है, लेकिन उनके पास सीमाएं हैं (संदर्भ 3 में समीक्षा की गई) एक अल्कोहल आहार का मौखिक भोजन केवल कृन्तकों में स्टेटोसिस का कारण बनता है 4 , </ Sup> 5 सूजन और फाइब्रोसिस का विकास या तो दूसरा अपमान 6 , 7 या पुराने इंट्रागास्ट्रिक इन्फ्यूजन की आवश्यकता है, जो कि आक्रामक और तकनीकी रूप से 8 , 9 को चुनौतीपूर्ण है। टेलीस्ट्रोस्ट zebrafish भी पुराने और तीव्र शराब उपचार 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 दोनों के जवाब में जिगर की चोट विकसित करता है। विशेष रूप से, लार्वा ज़ेब्राफिश एक आकर्षक पूरक मॉडल जीव का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें तीव्र शराबी यकृत की चोट 10 , 11 , 13 , 15 का अध्ययन करना है। Zebrafish जिगर कार्यात्मक है और 4 दिनों से इथेनॉल चयापचय के लिए महत्वपूर्ण एंजाइम पैदा करता है(डीपीएफ) 13 , 16 , 17। इथनॉल को सीधे पानी में जोड़ा जा सकता है, और 24 घंटे के लिए 2% इथेनॉल के संपर्क में जैब्राफिश्श लार्वा 13 , 15 में यकृत स्टेटोसिस और फाइब्रोजेनिक प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है।
यह बताया गया है कि 24 घंटे के लिए 2% इथेनॉल के उपचार के कारण ज़ेब्राफिश्श लार्वा 13 में 80 मिमी के ऊतक इथेनॉल एकाग्रता में परिणाम हुआ। दूसरों ने यह दिखाया है कि लार्वा इस एकाग्रता को बर्दाश्त करते हैं और इलाज वाले जानवरों में पाए जाने वाले यकृत फ़ोनोटाइप्स 11 , 13 , 15 , 18 के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, चूंकि 80 एमएम मनुष्यों में लगभग 1 9 घायल है, इसलिए इथेनॉल के इलाज के zebrafish और dete के जिगर ऊतक विज्ञान का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण हैमनुष्यों के लिए शारीरिक प्रासंगिकता rmine
ज़ीब्राफिश्श लार्वा का तीव्र बाह्य विकास और पारगमन वास्तविक समय और निश्चित नमूनों में यकृत के भीतर शराब की कार्रवाई को चिह्नित करना संभव बनाता है। कोशिका प्रकार-विशिष्ट फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनों की उपलब्धता और confocal microscopy में हाल की प्रगति तीव्र एथेनॉल उपचार 11 , 15 के जवाब में अलग-अलग जिगर सेल प्रकार कैसे उनके आकारिकी और व्यवहार को बदलने के अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं। हालांकि, फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक zebrafish के confocal इमेजिंग जिगर ऊतक विज्ञान का अध्ययन करते समय पूरी तरह से हेमटॉक्सिलिन और ईसिन (एच एंड ई) धुंधला के लिए विकल्प नहीं कर सकते हैं। ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग करते हुए एक ही समय में सभी यकृत सेल प्रकार को चिह्नित करने के लिए व्यक्तिगत ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी की आवश्यकता होती है, प्रत्येक लेबलिंग एक यकृत सेल प्रकार एक अद्वितीय फ्लोरोफोरे के साथ। एक ही मछली में अलग ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि पेश करने के लिए प्रजनन की आवश्यकता हैजी कई पीढ़ियों, जो समय लेने वाली और महंगा है अतिरिक्त मैट्रिक्स घटकों का पता लगाने के लिए अतिरिक्त इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेंसिंग की आवश्यकता होती है। दूसरी तरफ एच एंड ई धुंधला हो जाना, साथ ही साथ सभी यकृत सेल प्रकार और बाह्य मैट्रिक्स घटकों को लेबल करता है, इस प्रकार यकृत 20 का अवलोकन प्रदान करता है इसके अलावा, यह आसानी से यकृत रोग के कई हिस्टोपाथावैज्ञानिक विशेषताओं, जैसे कि हेपेटाइटा मौत, स्टीटोसिस और फाइब्रोसिस का पता चलता है। यद्यपि एचएंडई स्तनधारी यकृत ऊतक विज्ञान में नियमित रूप से दाग है, हालांकि इसका उपयोग सामान्यतः ज़ेबराफिष जिगर अनुसंधान में नहीं किया जाता है, और प्रोटोकॉल कम अच्छी तरह से स्थापित है।
यह काम zebrafish लार्वा में तीव्र इथेनॉल उपचार के लिए एक प्रोटोकॉल और एच एंड ई धुंधला हो जाना के साथ अनुवर्ती हिस्टोलोलॉजिकल विश्लेषण के लिए वर्णन करता है। जिगर विकास और कार्य के सभी अध्ययनों में एच एंड ई स्टैनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, पैराफिन वर्गों का उपयोग इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए और साथ ही अन्य विशेष स्टे के लिए भी किया जा सकता हैजिगर विकृति में आईएनएस, ट्रिक्रोम दाग, रेटिकुलिन का दाग, आदि सहित
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में zebrafish लार्वा में तीव्र इथेनॉल उपचार के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया और एच एंड ई धुंधला हो जाना के साथ बाद के हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण का वर्णन किया गया है। तीव्र ईथेनॉल उपचार 96 9 के बा?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ज़ीबराफिश अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र में डॉ कैटी मरे को स्वीकार करना चाहते हैं; डॉ। स्टैसी हूपर्ट और करि हूपर्ट, प्रोटोकॉल पर उनकी सहायक सलाह के लिए, सीसीएचएमसी में; और मछली देखभाल के लिए सीसीएचएमसी पशु चिकित्सा सेवा यह काम एनआईएच अनुदान R00AA020514 और सीसीएचएमसी (सीवाईएम) में बाल चिकित्सा जेनोमिक्स के केंद्र से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित था। यह भी सिनसिनाटी में पाचन रोग अनुसंधान केंद्र के एनआईएच अनुदान P30 DK078392 (एकीकृत रूपिकी कोर) द्वारा भाग में समर्थन किया गया था।
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
Riferimenti
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