Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em> Xenopus tropicalis</em
Summary
Denne protokollen demonstrerer en fluorescensbasert metode for å visualisere vaskulaturen og å kvantifisere kompleksiteten i Xenopus tropicalis . Blodkar kan bli avbildet minutter etter injeksjon av et fluorescerende fargestoff inn i et embryos slårhjerte etter genetisk og / eller farmakologisk manipulasjon for å studere kardiovaskulær utvikling in vivo .
Abstract
Blodkar leverer oksygen og næringsstoffer gjennom hele kroppen, og dannelsen av det vaskulære nettverket er under tett utviklingskontroll. Effektiv in vivo visualisering av blodkar og pålitelig kvantifisering av deres kompleksitet er nøkkelen til å forstå biologien og sykdommen i det vaskulære nettverket. Her gir vi en detaljert metode for å visualisere blodkar med et kommersielt tilgjengelig fluorescerende fargestoff, humant plasma acetylert lavdensitets lipoprotein DiI-kompleks (DiI-AcLDL), og for å kvantifisere deres kompleksitet i Xenopus tropicalis . Blodkar kan merkes med en enkel injeksjon av DiI-AcLDL inn i et embryo som slår på hjertet, og blodkar i hele embryoet kan avbildes i levende eller faste embryoer. Kombinert med genforstyrrelser ved målrettet mikroinjeksjon av nukleinsyrer og / eller badapplikasjon av farmakologiske reagenser, kan roller av et gen eller en signalvei på vaskulær utvikling være invektetØkte innen en uke uten å gripe til sofistikerte genetisk utviklede dyr. På grunn av det veldefinerte venesystemet av Xenopus og dets stereotypiske angiogenese kan spiring av eksisterende fartøy, kompleksitet av fartøy, kvantifiseres effektivt etter perturbasjonseksperimenter. Denne relativt enkle protokollen skal fungere som et lett tilgjengelig verktøy i ulike felt av kardiovaskulær forskning.
Introduction
Vaskulogenese, dannelsen av nye blodkar fra nyfødte endotelceller og angiogenese, dannelsen av nye fartøy fra eksisterende fartøy, er to forskjellige prosesser som danner embryonisk vaskulatur 1 . Eventuell dysregulering i disse prosessene resulterer i forskjellige hjertesykdommer og strukturelle abnormiteter i kar. Videre er tumorvekst assosiert med ukontrollert kar-vekst. Som sådan er molekylære mekanismer som ligger bak vasculogenese og angiogenese gjenstand for intens undersøkelse 2 .
Xenopus og sebrafisk er attraktive hvirveldyrsmodeller for vaskulogenese og angiogenesestudier, av flere grunner. For det første er deres embryoer små; Derfor er det relativt enkelt å bilde hele karet. For det andre er embryonisk utvikling rask; Det tar bare et par dager for hele vaskulaturen å utvikle, i løpet av hvilken tid utvikler vascul Ature kan bli avbildet. Tredje genetisk og farmakologisk inngrep før og under fartøydannelse er lett å utføre, for eksempel gjennom mikroinjeksjon av antisense morfolino nukleotider (MOs) i det utviklende embryo eller gjennom badapplikasjonen av legemidler 3 , 4 , 5 .
Den unike fordelen med Xenopus over sebrafisk er at embryologiske manipulasjoner kan utføres fordi Xenopus følger stereotypiske holoblastiske spaltninger, og det embryonske skjebnen er godt definert 6 . For eksempel er det mulig å generere et embryo hvor bare en lateral side er genetisk manipulert ved å injisere en antisense MO til en celle i tocelletrinnet. Det er også mulig å transplantere hjertet primordium fra ett embryo til et annet for å avgjøre om genet utøver sin funksjon ved hjelp av en celle-inneboende eller -ekstrinsisk mekanismeAss = "xref"> 7. Selv om disse teknikkene for det meste har blitt utviklet i Xenopus laevis , som er allotetraploid og derfor ikke er ideell for genetiske studier, kan de brukes direkte til Xenopus tropicalis , en nært beslektet diploid art 8 .
En måte å visualisere vaskulaturen på i et levende Xenopus- embryo er å injisere et fluorescerende fargestoff for å merke blodårene. Acetylert lavdensitetslipoprotein (AcLDL) merket med et fluorescerende molekyl som DiI er en meget nyttig probe. I motsetning til ikke-acetylert LDL, binder AcLDL ikke til LDL-reseptoren 9, men endocytteres av makrofager og endotelceller. Injeksjonen av DiI-AcLDL inn i hjertet av et levende dyr resulterer i den spesifikke fluorescensmerking av endotelceller, og hele vaskulaturen kan avbildes ved fluorescensmikroskopi i levende eller faste embryoer 4 .
Her presiserer viEnt detaljerte protokoller for visualisering og kvantifisering av blodkar ved hjelp av DiI-AcLDL i Xenopus tropicalis ( Figur 1 ). Vi gir viktige praktiske poeng, med eksempler på vellykkede og mislykkede eksperimenter. I tillegg gir vi en enkel metode for kvantitativ analyse av vaskulær kompleksitet, noe som kan være nyttig for å vurdere effektene av genetiske og miljømessige faktorer ved utformingen av det vaskulære nettverket.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen presentert her ble først utviklet av Ali H. Brivanlou og kollegaer for å undersøke utviklingshendelser under vaskulær formasjon i Xenopus laevis 4 , men som vist i dette manuskriptet, kan den brukes på andre små dyr. Fargestoffinjeksjon i hjertet er enkelt å utføre, og hele det vaskulære nettverket kan avbildes under et fluorescensdisseksjonsmikroskop, samt et konfokalt mikroskop. Hvis fargestoffet injiseres i hjertet under fartøyets utvikling, kan dynamikken i fart…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble inspirert av Levine et al. , Som beskrev denne eksperimentelle metoden og ga en omfattende beskrivelse av vaskulær utvikling i Xenopus laevis. Vi takker medlemmer av laboratoriet for deres innspill. Denne studien ble støttet av Yonsei Universitets fremtidsrettet forskningsinitiativ fra 2015 (2015-22- 0095) og Nasjonalt forskningsfonds bio- og medisinteknologiutviklingsprogram finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
Riferimenti
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
