Summary
Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.
Abstract
Filopodia, göç ve hücre-hücre iletişimi ile ilişkili dinamik, parmak benzeri hücresel çıkıntılardır. Filopodial başlatma, uzama ve daha sonra stabilizasyon veya geri çekmenin altında yatan karmaşık sinyal mekanizmalarını daha iyi anlamak için, bu dinamik yapılarda uzay-zamansal protein aktivitesinin belirlenmesi çok önemlidir. Filopodiya'daki protein fonksiyonunu analiz etmek için kısa bir süre önce filopodial şekil değişikliklerine uyum sağlayan yarı otomatikleştirilmiş bir izleme algoritması geliştirdik ve böylece tüm filopodial uzunluk boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve göreceli protein konsantrasyonunun paralel analizine izin verdik. Burada, optimize hücre işleme, görüntü toplama ve yazılım analizi için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Ayrıca görüntü analizi ve veri sunumu sırasında isteğe bağlı özelliklerin kullanımı ile ilgili talimatların yanı sıra yol boyunca tüm kritik adımlar için giderme yönergeleri sağlıyoruz. Son olarak, aynı zamanda dFilopodia niceleme için hazır bulunan diğer programlarla birlikte görüntü analiz yazılımını hazırlar. Sunulan protokol, birlikte görüntü analizi yazılımı kullanarak filopodial çıkıntılar protein dinamikleri doğru analiz için bir çerçeve sağlar.
Introduction
Aktin düzenleyici proteinlerin spatio-temporal kontrolü filopodium dinamikler 1 , 2 ile ilişkilidir. Zamanla tüm filopodial uzunluk boyunca uzaysal olarak çözülen protein konsantrasyonunun izlenmesi, bu dinamik yapıların başlatılması, uzatılması, stabilizasyonu veya çökmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir 3 , 4 . Birçok hücre şekli değişikliğinin daha büyük bir ölçekte gerçekleştiği sitoplazmada protein analizinin aksine, filopodiya, sürekli olarak 5 virajını kavrayan ve virüs oluşturan dinamik mikro yapılar olup, bu nedenle çizgi tarama gibi basit bir yaklaşımla analiz yapılmamaktadır.
Filopodial şekli izlemek için farklı yazılım özümleri mevcuttur 6 , 7 , 8 , 9 . LikewHücre gövdesi içerisindeki protein dinamiklerinin oraniyometrik izlenmesi için yazılım geliştirilmiştir. 10 , 11 . Filopodial şekil ve uzay-zamanlı protein analizinin otomatik izlenmesini birleştirmek için son zamanlarda konveks-gövde algoritmasına 12 dayalı bir görüntü analiz yazılımı geliştirdik. Bir grafiksel kullanıcı arabirimi (GUI) aracılığıyla çalıştırılan bu yeni analiz yöntemi, filopodial uzunluk ve büyüme hızı boyunca göreli protein konsantrasyonunu ilk kez birleştirir ve böylece uzay-temporal protein dağılımının bu ölçümlerin hareketlerinden bağımsız olarak doğru ölçümünü sağlar Dinamik yapılar 12 .
Yazılımın arkasındaki fikir (kaynak kodu serbestçe bulunur, aşağıya bakınız), konveks gövdesinin köşelerinden biri filopodyumun ucuyla örtüşecektir ( Şekil 1A ). Sonraki çerçeveye bakarak,Dışbükey gövdenin en yakın tepe noktası, hareketli uç tüm film boyunca izlenebilir. Ucu her karede algılandıktan sonra, konumu, filopodyum tabanında bir referans noktası ile ucu birleştirerek bir eksen çizmek için kullanılır ( Şekil 1B ). Son olarak, konumları eksene dik olan çizgide maksimum yoğunluk ile medyan piksel ile belirlenen eşit uzaklıktaki düğüm noktaları kullanılarak, filopodial şekli takip eden omurga belirlenir. Bu adaptif omurgadan yararlanarak, filopodial uzunluk boyunca üç kanala kadar filopodial büyüme ve protein konsantrasyonlarını izlemek için bir kymograph oluşturulur ( Şekil 1C ).
Şekil 1: Görüntü Analiz Yazılımının Çalışma Prensibi. ( A ) Arkasındaki algoritmayazılım. Adım1'de kullanıcı, filopodyumun referansını (tabanı) ve tepeyi (ucu) belirtir. Adım 2-1'de, filopodyumun omurgası, maksimum yoğunluk değerine sahip medyan piksel kullanılarak elde edilir. Adım 3'te omurga mekansal protein yoğunluğu profili için kullanılır. Adım 2-2'de, yazılım otomatik olarak sonraki çerçevedeki ucu izler. Bütün prosedür tekrarlanır. ( B ) İzlem için kullanılan konveks gövde gibi önemli elementleri sunan gerçek filopodyumlu algoritmanın anlık görüntüsü. ( C ) Algoritma ile ölçülebilen parametrelere genel bakış. Bu rakam referans 12'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Görüntü analiz yazılımı, grafiksel bir kullanım yoluyla Matlab'da (programlama yazılımı olarak anılır) çalıştırılırR arabirimi. Belli deneysel ayarlar için esneklik ve dayanıklılığı en üst düzeye çıkarmak için kullanıcı bir dizi izleme parametresini ayarlayabilir ( örneğin, izin verilen eğme açısı ve çerçeve içi hareketi) ve filmlerde bazı düzeltmeler yapabilir ( örneğin, kırpma, döndürme, istenmeyen nesnelerin giderilmesi) ( Şekil 2A ve Tablo 1) .
| GUI | Yok hayır. | Zorunlu | Açıklama | İsim (GUI'de) | ||||
| 1. | 1 A | Y | Hücre gövdesini (kutu işaretli olarak) gösteren yığınlanmış .tiff dosyasını yüklemek veya kanallardan üst üste yerleştirilen hücre gövdesi oluşturmak | Vücut hücresi | ||||
| 1. | 1b | Y | Protein 1 | |||||
| 1. | 1c | Y | Protein 2'ye karşılık gelen yığılmış görüntü dosyasını yükleme | Protein 2 | ||||
| 1. | 1d | Y | Protein 3'e karşılık gelen yığınlanmış görüntü dosyasını yükleme | Protein 3 | ||||
| 1. | 1e | N- | Önceden yüklenmiş yığılmış görüntü dosyalarına her şeyi sıfırlar | Reset | ||||
| 1. | 2a | Y | GUI penceresinde # 2 analiz için ilk kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu | NA | ||||
| 1. | 2b | Y | GUI penceresinde # 2 analiz için son kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu | NA | ||||
| 1. | 2c | Y | Curre'yi temsil eden kaydırma çubuğuNt çerçevesi | NA | ||||
| 1. | 2d | N- | Tüm piksellerin altında sıfıra ayarlanacağı piksellerin gri değeri | NA | ||||
| 1. | 2e | N- | Yukarıdaki tüm piksellerin maksimum değerlere ayarlanacağı piksellerin gri değeri | NA | ||||
| 1. | 2f | N- | <2e> & <2f> ile belirtilen piksellerin yoğunluk değerlerini ayarlayın. | Set | ||||
| 1. | 2 g | N- | Yoğunluğu ayarlanmış filmi oynat | Oyun | ||||
| 1. | 2s | N- | Görüntüyü kırp | ekin | ||||
| 1. | 2i | N- | Resmi Döndür | Döndürme | ||||
| 1. | 2j | N- | Tüm yığında bölgeleri sil | Bölgeleri sil | ||||
| 1. | 3 A | Y | 'Analiz Penceresi'ni açmak için tıklayın (GUI penceresi # 2) | İzleme Penceresi | ||||
| 1. | 3b | Y | Mikron cinsinden bir piksel boyutunu girin | Piksel boyutunu girin | ||||
| 2. | 4 | Y | Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin sınır / kenar görüntüsünü oluşturmak için tıklayın | Sınır | ||||
| 2. | 5 | Y | Filopodiyanın taban ve ucunu seçmek için tıklayın | Referernce | ||||
| 2. | 6a | Y | Segmentlerin veya düğümlerin sayısını girin | Segment sayısı | ||||
| 2. | 6b | Y | Tarama uzunluğunu girin (eksene dik olarak) | Tarama Genişliği | ||||
| 2. | 6c | Y | Filopodinin yukarıya doğru bükülmeye başlama uzunluğunu girin | Sonra Doğru Ölçümler | ||||
| 2. | 6d | Y | İpucu algılama çemberinin yarıçapını girin (yani, vertex'in bir sonraki çerçevede lokalize edilebileceği alan) | İpucu algılama yarıçapı | ||||
| 2. | 6e | Y | Filopodium'un dikey eksenden kıvrılabileceği maksimum açıyı girin | Açı Eşiği | ||||
| 2. | 6f | N- | Belirli çerçeve için taban ve uç için referans noktaları ekleyin | Referans seç | ||||
| 2. | 6g | N- | Belli bir çerçeve için filopodinin bükülmeye başlandığı uzunluğu girin | Sonra Doğru Ölçümler | ||||
| 2. | <td> 6hN- | Belirli çerçeve için algılama çemberinin yarıçapını girin | İpucu algılama yarıçapı | |||||
| 2. | 6i | N- | Belirli bir çerçeve için tüm parametreleri girdikten sonra, daha sonraki referanslar için bellek ve dosyalara değerleri depolamak için tıklayın. | Eklemek | ||||
| 2. | 6j'nin | N- | Bu karenin elle ayar parametrelerini silmek için tıklayın | silmek | ||||
| 2. | 6k | N- | Tüm kareler için 'isteğe bağlı özellikler paneli' kullanılarak manuel olarak saklanan tüm parametreleri silmek için tıklayın | Reset | ||||
| 2. | 6l | N- | Gelecekteki referans için tüm izleme sonuçlarını belleğe kaydetmek için izleme işleminden önce kontrol edin | Geçmiş izi | ||||
| 2. | 7 | Y | İzlemeyi başlatmak için tıklayın | Takip ve Analiz | ||||
| 2. | 8a | N- | Protein kanalı yoğunluğunu izlemeye başlamak için tıklayın | Protein yoğunluklarını analiz edin | ||||
| 2. | 8b | N- | Filopodial uzunluk boyunca protein kanal yoğunluğunu izlemek için kontrol edin | Bütün filopodi | ||||
| 2. | 8c | N- | Referans proteinini veya protein A'yı izlemek için kontrol edin | Protein A | ||||
| 2. | 8d | N- | B proteinini izlemek için kontrol edin | ProteinB | ||||
| 2. | 8e | N- | Proteini C izlemek için kontrol edin | ProteinC | ||||
| 2. | 8f | N- | Ortalama protein yoğunluğunu izlemek için kontrol edin.E uç | Öne çıkan ipucu | ||||
| 2. | 8g | N- | İpucunun uzunluğunu girin | İpucu Uzunluğu | ||||
| 2. | 8h | N- | Ucun üstünde şekillendirme başladığı minimum mesafeyi girin | eşik | ||||
| 2. | 8i | N- | Öncü ipucu analiz sonuçlarını dosyaya kaydetmek için tıklayın. | Butona basınız | ||||
| 2. | 9a | N- | Ratiyometrik protein analizi başlatmak için tıklayın | Karşılaştırmak | ||||
| 2. | 9b | N- | A proteinine B proteinini karşılaştırmak için giriş yapın. | log 10 (B / A) | ||||
| 2. | 9c | N- | Protein C'yi A'ya göre karşılaştırmak için kontrol edin | log 10 (C / A) | ||||
| 2. | <td> 9dN- | Protein B'yi uçtaki A'ya göre karşılaştırmak için kontrol edin | log 10 (B / A) | |||||
| 2. | 9e | N- | Protein C'yi uçtaki A'ya göre karşılaştırmak için kontrol edin | log 10 (C / A) | ||||
| 2. | 10a | N- | Diğer renk haritasını seçin (varsayılan: Jetplot) | Renk Haritası | ||||
| 2. | 10b | N- | Renk haritasını düzenle | Renk haritasını düzenle | ||||
Tablo 1: GUI'de Bulunan Tüm İşlevlere Genel Bakış Windows # 1 ve # 2.
Bu gerçekleştirildiğinde, program bir konveks gövde oluşturur ve film boyunca ucu otomatik olarak izler. Filmden çıkarılan parametreler, örneğin bir sıçanometrik kymograph, büyüme hızı ve filopodial uzunluk aYeniden görüntülenir ve iş klasörüne görüntüler ve veri dosyaları olarak saklanır. Filopodial yaşam süresi, büyüme hızı ve geri çekme oranı gibi diğer parametreler daha sonra çıkarılabilir ve depolanmış veri dosyalarından daha fazla analiz edilebilir ( Şekil 2B ).
Şekil 2: Görüntü Analiz Yazılımının Kullanımı için Grafik Kullanıcı Arayüzü. ( A ) GUI Penceresi # 1, resim yüklemek ve işlemek için kullanılır. Program 3 kanala kadar yükleyebilir, böylece 2 kanal karşılaştırılır. Pencere, izlemeden önce görüntülerin ön işleme tabi tutulması için zorunlu (mavi) ve isteğe bağlı özellikler (yeşil) ile birlikte gelir ( B ) GUI Pencere # 2, filopodyumun yanı sıra zamansal ve oran-metrik protein analizi izlemek için kullanılır. Yine, isteğe bağlı özellikler yeşil olarak işaretlenmiştir. Bu rakam modifi olduKaynakça 12 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Burada, örnek hazırlama ve yazılım kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Hücrelerin kültürlenmesi ve görüntü analizi için optimize edilmiş filmlerin edinilmesi ile ilgili ayrıntılı talimatlarla başlayacağız. Veri edinimi ile ilgili bu bölüm, görüntü analiz yazılımını çalıştırmak için ayrıntılı bir açıklama izliyor. Protokol boyunca, verileri toplamak ve işlemek için dikkate alınması gereken kritik adımları ve isteğe bağlı özellikleri tanıtmaktayız. Son olarak, açıklanan görüntü analiz yazılımının filopodial niceleme için mevcut olan diğer programlarla karşılaştırılması ve sınırlamalar ve geleceğe yönelik bir tartışma ile kapanmadan önce, filopodiyi görüntü analiz yazılımı ile farklı model sistemlerinden analiz ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Kültürü
- 4.5 g / L D-glükoz, L-alanin-L-glutamin dipeptid, piruvat,% 10 sığır fetüsü serumu ve 10 ünite / ml penisilin / streptomisin içeren Dulbecco'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamında (DMEM) Kültür HeLa veya COS hücreleri. 0.5 mM L-alanin-L-glutamin dipeptid, serumsuz nöronal takviyeleri ve 10 ünite / ml penisilin / streptomis ile takviye edilmiş L-glutamin, glutamik asit veya aspartik asit içermeyen kültür ortamındaki kültür nöronları.
- % 40 confluency ulaşıldığında, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak seçim yapıları ile transfekte hücreleri. 37 ° C'de inkübe edilen transfekte hücreleri tutun ve 15-18 saat boyunca% 5 CO 2 .
- Görüntü alımı sırasında pH ve ozmolarite (buharlaşma nedeniyle) değişiklikleri azaltmak için, hücre kültürü odalarını (görüntülemeye başlamadan önce)% 90'a kadar, 20 mM 4- (2-hidroksietil) -1 içeren 37 ° C önceden ısıtılmış ortam ile doldurun -piperazinetansülfonik asit (HEPES). MühürlemekKapak, vakum gres ince bir tabaka içinde kapağın iç uygulayın ve yavaşça transfekte hücreleri içeren kültür odası üzerine bastırın.
2. Görüntü Edinimi
NOT: Filopodiya uzunluğu 2-10 μm3 arasında değişir 13 . Filopodia ortalama hız 0.05-0.1 μm / sn'de büyür 13 , 14 .
- 60X veya 100X objektif ve hiçbir piksel binning (burada bir dönen disk konfokal mikroskop) ile bir mikroskop kullanılarak görüntü elde edin. Filopodial dinamikleri izlemek için 1 Hertz'den (Hz) büyük edinim hızları kullanın. Odak dışı nesneleri en aza indirgemek için görüntü filopodisi bazal membrana ( yani substrat yüzeyi) yakındır.
- Düzgün izlemeyi sağlamak için kameranın maruz kalma zamanını ve lazer yoğunluğunu, sinyal / gürültü oranı (SNR) 4'ten büyük olacak şekilde ayarlayın. Bireysel kanalların doygunluğundan kaçının ( örn .255 8-bit görüntüler için 65.535 16-bit görüntüler için), daha sonraki görüntü analizini engelleyecektir.
- Kanamayı önlemek için, lazer çizgileri ve mikroskop filtreleri ile uyumlu floresan etiketleri kullanın (ayrıntılar için bkz. Referans 15 ).
3. Görüntü Ön işleme
NOT: Görüntüleri önceden işleme koymak için ImageJ veya diğer mevcut yazılımı kullanın 16 , 17 .
- Örnek hareket ediyorsa, analiz öncesinde mevcut yazılımları kullanarak yanal sürüklenmeyi düzeltin ( örn. Https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ). Filmleri eksenel sürüklenme (yani, z-yönünde hareket) ile hariç tutun.
- Doğru arka plan ( yani hücrenin dışındaki alanların gri değerleri), ağartma ( yani , flüoresans proteinlerine hasar vermesi nedeniyle floresan yoğunluğu varsa sürekli kaybı) ve olası kanama yalakı ( yani , bir gribten gelen sinyal(Örn. Http://imagej.net/Category:Plugins ve 16 , 17 ) kullanarak).
Not: Münferit kanalların floresan yoğunluğu yazılım tarafından değiştirilmez. - Sonraki görüntü analizini sağlamak için, belirli protein kanallarına karşılık gelen filmleri, gri tonlamalı olarak '.tiff' yığınlı dosya formatı olarak çalışma klasörüne kaydedin.
NOT: İstiflerin boyutları (boyut, uzunluk) tüm kanallar için aynı olmalıdır.
4. Görüntü Analizi - Adım 1: Resim Yükleme
NOT: Burada açıklanan yazılım Matlab'da (programlama yazılımı olarak anılır) yazılmıştır ve yalnızca bu program ile çalışır.
- Görüntü analizleri için gerekli tüm dosyaları içeren sıkıştırılmış klasörü aşağıdaki siteden indirin: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwdır-dir/. Dosyaları iş klasörüne sıkıştırın ve kopyalayın.
- Kurulduktan sonra programlama yazılımını açın ve 'filopodiaAnalysisM3.fig' dosyasını çalıştırın. GUI Penceresi # 1 Şekil 2A'da gösterildiği gibi açılacaktır.
- Belirli bir proteine karşılık gelen kaydedilmiş yığınlanmış '.tiff' dosyalarını, protein C için <1b> protein B, <1c>, protein C için <1d> düğmelerini kullanarak GUI Pencere # 1'e yükleyin. Bkz. Şekil 2 ve Tablo 1 ayrıntıları için.
NOT: GUI Penceresi # 1'de gösterilen Protein A, nihai rasyonel analiz için referans kanalı görevi görür. - <1a> 'yı tıklayarak protein kanallarından hücre üst üste imajı oluşturun.
- İlk kareyi atamak için <2a>, analiz için kullanılan son kareye <2b> tıklayın.
- İsteğe bağlı olarak, <2h> düğmesini kullanarak ilgilenilen filopodiumu içeren ilgi alanını (ROI) kırpın, resmi döndürünüz u<2i> deyin veya serbest el çizim aracını <2j> kullanarak istenmeyen bölgeleri silin.
NOT: Görüntü analizini kolaylaştırmak için ImageJ kullanarak ROI'yı (diğer bir deyişle kırpma, döndürme, silme) diğer ön işleme adımlarıyla (arka plan çıkarımı, çamaşır suyu düzeltmeleri vb.) Ayırmanız önerilir. - Kalite kontrolü için her çerçeve için kaydırıcıyı hareket ettirin ve filmin tamamında filopodyumun açıkça görülebileceğini kontrol edin.
5. Görüntü Analizi - Adım 2: İz Yaratın
- GUI Pencere # 2'yi açmak için GUI Pencere # 1'deki <3a> düğmesine tıklayın ( Şekil 2B'ye bakın).
- Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin maskesini oluşturmak için GUI Penceresi # 2'deki <4> düğmesine tıklayın (<1a> 'yi tıkladıktan sonra GUI Penceresi # 1'de oluşturulur). Program aynı zamanda vertex noktalarını elde etmek için konveks gövde uygulandığı maskenin sınırını oluşturur.
- cliCk düğmesi <5>; Bir imleç belirecektir. İmleci (filopodial ucu mesafesinin ölçülmekte olduğu) tabanı ve ardından ilk göründüğü çerçevedeki filopodinin ucunu seçmek için imleci kullanın. Bunu yapmak için kaydırıcıyı Pencere # 2'de hareket ettirin).
NOT: Veri çıkışındaki hataları en aza indirgemek için, taban noktasını eksene göre filopodial ucun altına dikey olarak yerleştirin. Taban noktasının başka yerlere yerleştirilmesi ( örneğin yanal olarak kaydırılmış olması), hücre gövdesi içerisindeki floresans değerlerinde yönsel bir önyargı ortaya çıkarabilir. - <6c> 'yi kullanarak eşik uzunluğunu (filopodinin üzerinde bükülecek) seçin.
Not: Bu uzunluk, taban noktası (<5> kullanılarak seçilen) ile hücre gövdesinin sınırı (filopodinin büyümeye başladığı bölge) arasındaki uzaklık olarak tanımlanır. Mesafe piksel olarak ölçülür. - <6a> kutusunda filopodiya şekline yaklaşmak için kullanılan kesim sayısını belirtin.
NOT: mEn az sayıda bölüm, filopodyum tarafından ulaşılan maksimum uzunluğa, ayrıca filopodyumun nasıl bükülmesine bağlıdır. Taban ve ucu arasındaki piksel sayısından daha büyük sayıda segment ( örn . Eşik uzunluğu) seçmeyin. Adım 5.4'te tanımlanan eşik uzunluğundan daha fazla segment seçme. ( Yani taban ve uç arasındaki piksel sayısı) filopodyumun uzunluğunun bir tahmini ile sonuçlanacaktır. - Düğümleri yerleştirmek için yatay tarayıcı görevi gören tarama genişliğini <6b> olarak belirtin.
NOT: Bu düğümler, program tarafından, filopodyumun gövdesi ile taban ve ucu birleştiren çizginin ( yani omurgasını oluşturmak için) sığdırılması için kullanılır. Bir başlangıç noktası olarak, maksimum uzunluğa bir faktör ile çarpılmış piksele bir değer koyun
. - <6d> kutusunda tarama yarıçapını (piksel cinsinden) belirtin. Ob'dan yaklaşık% 50 daha büyük bir değer kullanınÇerçeveler arası uç yer değiştirmesini sağladı.
NOT: Çok büyük bir tarama yarıçapı kullanmak, gerçek filopodial ucu bulunmayan çerçevelerde istenmeyen konveks gövde noktalarını yakalayabilir ( örneğin düzlem dışı hareket veya düşük SNR). - Kutu <6e> 'de eğme açısını belirtin.
NOT: Açı eşiği, bütün analiz sırasında filopodyumun bükülmüş maksimum açısı ile belirlenir. Açı eşiğini belirtmek, filopodiya hücre gövdesine doğru eğildiğinde yazılımın filopodiya yanından büyüyen istenmeyen yapıların izlemesini hariç tutmasına yardımcı olur. Program dikey eksenden 45 dereceden daha az eğilme açısı ile filopodiya için güvenilir şekilde çalışır. - İzlemeye başlamak için GUI Penceresi # 2'deki <Track & Analyze> düğmesini tıklayın. Gelecekteki referans için tüm izleme protokolünü kaydetmek için GUI Penceresi # 2'deki 'Geçmiş izlemesi' kutusunu tıklayın.
NOT: İzleme işlemi tamamlandıktan sonra, her karedeki filopodyumun uzunluğu,Gelecekteki başvurular için 'dynamics.xlsx' dosyasının 'length_vel' adlı sayfası. Aynı şekilde, diğer tüm izleme parametreleri 'dynamics.xlsx' parametrelerinde saklanır. - İsteğe bağlı olarak, filopodiya tüm karelerde otomatik olarak algılanmazsa, elle düzeltmek için aşağıdaki adımları kullanın.
- Pencere # 2'deki kaydırıcıyı kullanarak ilgili çerçeveyi ziyaret edin ve elle filopodyumun ucunu seçin.
Not: Dışbükey gövde noktalarının bulunmadığı çerçeveler, GUI Penceresi # 2'nin izleme penceresinde mavi bir bölge ile temsil edilecektir. Bu çerçeve içindeki düğüm koordinatlarına erişmek için izleme programı başlatılmadan önce 'Geçmiş izi' düğmesini kontrol etmek zorunludur. - GUI Penceresi # 2'de <6f> kullanarak referans noktalarını (taban ve ipucu) seçin. 'Tarama uzunluğu', 'Sonradan Hassas Ölüm' ve 'maksimum eğme açısı' gibi diğer parametreleri belirtin; 5.4-5.8 adımlarında açıklandığı gibi bu çerçeve için.
- Yeni parametreleri kaydetmek için <6i> düğmesine tıklayın (bir kareye özgü). Adımlar mavi bölgenin gösterdiği tüm kareler için tekrarlanmalıdır.
- İşiniz bittiğinde, <7> tuşunu kullanarak izleme prosedürünü yeniden başlatın.
NOT: Bu düzeltme, program bir filmdeki bir filopodialden aniden geçiş yaparsa da kullanılabilir. Alternatif olarak, birden fazla filopodiyi içeren filmleri kırpmayı düşünün.
- Pencere # 2'deki kaydırıcıyı kullanarak ilgili çerçeveyi ziyaret edin ve elle filopodyumun ucunu seçin.
. 6. Görüntü Analizi - 3. Adım: Spatio-temporal Protein Analizi
- Uzay-zaman analizi için, <8b> ile temsil edilen kutuyu ve ardından ilgili protein kanalı (<8c> ve / veya <8d> ve / veya <8e>) seçin.
Not: Protein A referans olarak kullanıldığından, rasatometrik analizden (<9a>, <9b> ve / veya <9c>) önce Protein A seçilmesi zorunludur. - <8a> 'yı tıklayın5.9. Adımda üretilen izi kullanarak filopodial uzunluk boyunca protein izlemeyi başlatmak için.
7. Görüntü Analizi - 4. Adım: Oran-metrik Protein Analizi
- Uzay-zamansal oranlamalı grafiği elde etmek için <9b> veya <9c> onay kutusunu işaretleyin ve <9a> düğmesine tıklayın.
NOT: Göreceli protein konsantrasyonunun yanlış gösterilmesini önlemek için, ratiyometrik görüntü X / Y olarak değil, log (X / Y) olarak çizilmemektedir. İleride kullanılması için, ratiyometrik grafiğe '.png' ve '.fig' format dosyaları verilir ve gebelik verisi 'dynamics.xlsx' dosyası içinde saklanır.
8. Görüntü Analizi - Adım 5: Filopodial İpucu Analizi
- <8f> onay kutusunu işaretleyin ve ucu uzunluğunu ve eşik uzunluğunu <8g> ve <8h> kullanarak tabandan belirleyin. Verileri 'dynamics.xlsx' dosyasına kaydetmek için <basma düğmesine> tıklayın. <Protein yoğunluklarını analiz> seçeneğini tıklayarakFilopodial ucun protein yoğunluklarının izini sürmek ve rasatiyometrik analiz için tasarruf sağlamaktır.
NOT: İpucu uzunluğu, analiz için kullanılan uçtaki piksel sayısını belirler. Yazılım, her çerçevedeki uçtaki piksellerin ortalama yoğunluk değerini döndürür. Eşik uzunluğu, filopodyumun (filopodial ucu) büyümeye başladığı (ve program ucun yoğunluk değerini izlemeye başladığında) tabandan uca minimum mesafeyi belirler. Bu nedenle uç uzunluğu eşik uzunluğundan daha küçük olmalıdır. - <9d> veya <9e> kullanılarak analiz edilecek arzulanan oranı tıklayın.
- Orantılı verileri oluşturmak için karşılaştırma düğmesini <9a> tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Filamentöz aktin (f-traktin 18 , kırmızı) ve sitosolik referans (yeşil) için bir markör ile transfekte edilmiş COS hücrelerini kullanarak, aktin bakımından zengin filopodial çıkıntıları bulduk ( Şekil 3A , üst panel). Zaman serileri, filopodinin hızla uzaması ve geri çekilmesi olduğunu gösterdi ( Şekil 3A , orta panel). Görüntü analiz yazılımını kullanarak, bireysel filopodiyi izledik. El ile görüntü analiz yazılımı ile ölçülen filopodial uzunluğun karşılaştırılması, yazılımın güvenilir bir şekilde filopodial uzantıyı 12 izlediğini savunan 0.947 Pearson çapraz korelasyon değeri gösterdi. Tek bir filopodiya'nın büyüme ve geri çekilme oranlarına ek olarak, Şekil 3A'nın altındaki kymograph'lar ayrıca aktin (üst), sitosolik referansın (orta) flüoresan yoğunluklarını ve sitoso'ya normalize edilmiş aktinin nispi konsantrasyonunu tasvir ederLisans referansı (alttaki). Birlikte, bu deneyler, programın, COS hücrelerindeki tek bir filopodyumun tam yaşam döngüsü boyunca uzamsal olarak çözünmüş nispi protein konsantrasyonunun yanı sıra, büyüme dinamiklerini güvenilir bir şekilde ölçtüğünün kanıtı sağlar.
Sonra, kültürlü fare hipokampal nöronlardaki filopodia dinamiklerini araştırdık ( Şekil 3B , üst panel). Bunun için nöronlar in vitro (DIV) 8 gün f-traktin (kırmızı) ve sitosolik referans (yeşil) ile transfekte edildi ( Şekil 3B , orta panel). Önceki deneydeki gibi, aktin'in floresan yoğunluklarını ve sitosolik referans gösteren kymograph'larda, aktinin nispeten zenginleşmesinin, keşif dendritik filopodisinin oluşumundan önce geldiği gösterildi ( Şekil 3B , alt panel). Bu bulgular yayınlanan çalışmayla uyumludur ve filopodialden önce aktin bakımından zengin lekelerin oluşumunu açıklamaktadırUzama 3 , 19 , 20 .
Şekil 3: Yazılım Tarafından Analitik Filopodiya Örnekleri. ( A ) f-traktin (kırmızı) ve sitosolik marker (yeşil) ile transfekte edilmiş COS hücrelerinin genel görünümü (üst panel) ve zaman serileri (orta panel). Aşağıda, filopodial büyüme dinamikleri ve filopodyumdaki f-traktinin nispi konsantrasyonunu (alt paneller) gösteren arsalar gösterilmektedir. ( B ) Sitoplazmalı markerle (üstte) transfekte edilen hipokampal nöronun genel görünüşü ve f-traktin (kırmızı) ve sitosolik markör (yeşil) ile transfekte edilmiş nöron zaman serisi (orta panel) yanı sıra dendritik filopodial büyüme dinamikleri analizini tasvir eden çizim Ve çıkıntı boyunca f-traktinin nispi konsantrasyonu (alt paneller).( C ) SEM görüntüsü (sol panel) ve f-traktin ile transfekte edilmiş HeLa hücrelerinin zaman serileri (sağ panel). Filopodial çökmeye bağlı floresan yoğunluğundaki dalgalanmaları not edin. Ölçek çubukları = 20 μm (A, üst), 50 μm (B, üst), 10 μm (C, üst). Bu rakam referans 12'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Son olarak, Filopodiyi HeLa hücrelerinde izleyerek yazılımı sorgulamayı hedefledik. HeLa hücrelerindeki Filopodia uzun ( Şekil 3C , sol panel) ve son derece dinamik, genellikle edinim düzleminden ayrılıyor. İlginç bir şekilde, bazal membrana odaklanırken filopodiya alt fraksiyonunun sarmal büküm ( Şekil 3C , sağ üst panel) geçirdiğini gözlemledik, böylece filopodyum transIently odak düzleminden çıktı. Buna göre, f-traktinin mutlak floresan yoğunluğunu gösteren kymographlar zamanla floresan yoğunluğunda dalga benzeri değişiklikler gösterdi ( Şekil 3C , sağ alt panel). Bu davranış filopodial çöküşü anımsatır, son zamanlarda filopodia tarafından çekme kuvvetleri uygulanması için kullanılan bir mekanizma 5'i hatırlatır.
Özetle, bu deneyler, yazılımın çeşitli kökenlerden filopodialin protein konsantrasyonunu ve büyüme dinamiklerini güvenilir şekilde izlediğine dair kanıtlar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, filopodial büyüme dinamikleri ve konveks gövde algoritması yoluyla bu dinamik yapılardaki bağıl protein konsantrasyonlarının izlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Yazılımı kullanarak, iki kanalın ( yani proteinler) göreli konsantrasyonlarının uzatma / geri çekme çevrimi boyunca belirlendiği ve ayrı klasörler halinde görüntü ve veri dosyaları olarak depolandığı tek bir programda üç kanala tek tek karşılaştırılabilir. Yazılım, rutin işlemlere ek olarak, ilgili deney için analizin optimize edilmesi için değiştirilebilecek bir dizi parametre de sağlar. Bu değişikliklerin yanı sıra sorun gidermeyle ilgili ayrıntılı açıklamalar, protokol bölümünde ve Tablo 1'de bulunabilir .
Görüntü analizi belirli bir mikroskop tipi ile sınırlı değil, zaman serilerinin görüntü kalitesiyle sınırlı değildir. Bu nedenle, alakalılığı göz önünde bulundurarak, görüntü kalitesi, eKanal kazanıyor. Yaptığımız deneyler, algoritmanın 40X üzerindeki büyütme ve hiçbir piksel bölme olmadan bir objektif kullanarak 1 Hz'de elde edilen SNR> 4 olan filopodiya için en iyi sonuç verdiğini göstermektedir. Tabii ki, bu sadece floroforlar filtre ayarlarıyla uyumlu olduğu sürece geçerlidir ( örneğin boşaltma yok; ayrıntılar için protokol bölüm 2'ye bakınız). Bağıl yoğunlukların birbiri ile karşılaştırıldığında, analiz tek tek hücreler arasındaki mutlak floresan sinyal yoğunluklarındaki küçük farklılıklara duyarlı değildir. Dolayısıyla, anlamlı veriler bulmak için, iyi tanımlanmış bir referans kanalı ( örn. Sitosolik markör) büyük önem taşır. Bununla birlikte, görüntü kalitesi iyi olmasına rağmen bazı biyolojik kısıtlamalar vardır. Örneğin, dallanma, hücre yüzeyine dikey eksenden 45 derece daha eğik yapılar veya diğer nesneler araştırılan yapıyı aşan yapıları analiz etmek için uygun değildir.
<P class = "jove_content"> Bu deneysel sınırlamalara ek olarak, başka bir deyişle hata mesajlarını tetikleyebileceğinden, yazılımı çalıştırırken dikkate alınması gereken önemli adımlar vardır. İlk olarak, belirli bir proteine karşılık gelen kanalların boyutu aynı olmalı ve tam olarak aynı ROI'yi temsil etmelidir. İkinci olarak, yığılmış dosyalar gri tonlama '.tiff' dosya biçiminde olmalıdır. Üçüncü olarak, yığılmış görüntü dosyaları çalışma klasöründe olmalıdır. Ve son olarak, çalışma klasöründeki veri dosyaları için adlar, kodda düzeltilmedikçe değiştirilmemelidir.Komut dosyası mevcut diğer yöntemlerle nasıl karşılaştırılır? Görüntü analiz yazılımımızı incelemek için, filopodial özellikleri analiz eden, 6 , 10 , 21 , 22 , 23 ve 24 numaralı son zamanlarda yayınlanmış birkaç yazılım çözümü indirildi. , 25 ve seçilen bazı ölçütler için hepsini test ettik. Ayrıntılı bir karşılaştırma Tablo 2'de sunulmuştur.
| Tsygankov ve ark. | Barry ve ark. | Nilufar ve ark. | Fanti ve ark. | Constantino ve ark. | Hendri- Cusdottir ve ark. | Tarnok ve ark. | Saha ve ark. | |
| Kağıt DOI | 10,1083 / jcb.201306067 | 10,1083 / jcb.201501081 | 10.1186 / 1752-0509-7-66 | 10.1002 / dneu.20866 | 10.1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 | 10.1016/j.jneumeth. 2014.08.016 | 10.1002 / cyto.a.22569 | 10,1091 / MBC. E16-06-0406 |
| Yazılım (indirme bağlantısı) | http: //www.hahnlab. com / araçlar / softwarepage. html | http: // JCB-dataviewer. rupress.org/jcb/ göz / 9059 / | http: //www.perkinslab .ca / pubs / NMLP20XX. html | http: //www.ifc. unam.mx/ ffm / download.html | http: // fournierlab. mcgill.ca/ tarz-7 / fTracker.html | https: // fdynamics. wordpress.com/ | http: // cnblab. elte.hu/dfma | https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&L=1 |
| Program türü | Matlab | ImageJ | Matlab | ImageJ | Matlab | Matlab | ImageJ | Matlab |
| operasyon | otomatikleştirilmiş | otomatikleştirilmiş | otomatikleştirilmiş | Yarı otomatik | Yarı otomatik | Yarı otomatik | Yarı otomatik | Yarı otomatik |
| Tek ve yığın analizi | her ikisi de | her ikisi de | tek | tek | tek | tek | tek | tek |
| Tüm hücre ve subregion analizi | bütün | bütün | her ikisi de | her ikisi de | her ikisi de | alt | alt | alt |
| Bireysel filopodiya karşı çok | çoklu | çoklu | çoklu | çoklu | çoklu | ind | ind | ind |
| Filopodial kimlik ve görsel muayene mümkün | Evet | Evet | yok hayır | Evet | Evet | Evet | Evet | |
| Görüntü işleme olasılığı | yok hayır | yok hayır | yok hayır | Evet | yok hayır | yok hayır | yok hayır | Evet |
| Filopodial uzunluk | Evet | Evet | Evet | Evet | Evet | Evet | Evet | Evet |
| Filopodial büyüme dinamikleri | Evet | Evet | yok hayır | Evet | Evet | Evet | Evet | Evet |
| Filopodial ömür boyu | Evet | Evet | yok hayır | Evet | Evet | Evet | Evet | Evet |
| Filopodiya rasyoskopik analiz | yok hayır | yok hayır | yok hayır | yok hayır | yok hayır | yok hayır | yok hayır | evet </ Td> |
| Çıktı / depolama biçimi | Resimler / veri dosyası | Resimler / veri dosyası | Resimler / veri dosyası | Resimler / veri dosyası | Resimler / veri dosyası | Resimler / veri dosyası | Resimler / veri dosyası | Resimler / veri dosyası |
Tablo 2: Filopodia Niceleme için Yazılım Destekli Görüntü Analiz Çözümlerine Genel Bir Bakış.
Sekiz test analiz yazılımı çözümünden, beşi Matlab ile, diğer üçü ise ImageJ kullanılarak çalıştırıldı. İki yazılım çözümü (soldaki Tablo 2 ) tamamen otomatikleşti ve tüm hücrelerdeki filopodia uzunluğu, yaşam süresi ve dinamiklerinin seri analizi için optimize edildi. Geriye kalan altı yazılım çözümünün beşi manuel girdi gerektirdi (yarı otomatik), biri tamamen otomatikti. Ancak, sadeceYarı otomatikleştirilmiş çözümler, filopodia büyüme dinamikleri, yaşam süresi ve kimlik hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Geri kalan beşte üçü bireysel filopodinin subselüler analizi için optimize edilmişken, ikisi paralel olarak çok filopodiyi işleyebilir. Önemli bir nokta, test edilen sekiz yazılımın hepsinden, filopodial büyüme dinamikleri ve parmak benzeri yapılardaki rasyoskopik protein lokalizasyonu hakkında bilgi tek bir yaklaşımla birleştirilmesine izin verildi ( Tablo 2 , sağda).
Görüntü analiz yazılımımız otomatik seri veya tam hücre analizi için uygun olmasa da, izole bir filopodinin miktarının belirlenmesi yalnızca birkaç dakika alır. Bu nedenle, 40-50 filopodideki protein dinamiklerinin miktarının mevcut yazılımla tek bir gün içinde ölçülmesinin mümkün olduğunu düşünüyoruz. Buna karşın, yüksek verimli ekranlar, binlerce bireysel filopodinin girişi ve depolanmasını otomatik hale getirmek için kodu daha fazla değiştirmeyi gerektirebilirtavır. Gerekli parametrelere dayanarak, bu nedenle mevcut diğer yazılım çözümleri bu tür bir yaklaşım için daha uygun olabilir. Bu kısıtlamaları göz önünde bulundurarak, yazılım, hücrelerdeki protrüzyon benzeri yapılarda uzaysal-zamansal protein konsantrasyonunun araştırılması için güvenilir bir platform sağlar. Filopodia'nın parmak benzeri tek hücresel yapılar olmadığını düşünürsek, sunulan görüntü analiz yazılımının diğer biyolojik süreçlerde protein dinamiklerini ( örn., Nevritler, primer silya) incelemek için uygun olabileceğini düşünmek de akla uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, DFG'den (MG için EXC-1003) finansman sağlamışlardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
References
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses. Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).
- Galic, M., et al. Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons. Elife. 3, e03116 (2014).
- Hotulainen, P., et al. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).
- Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Helical buckling of actin inside filopodia generates traction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
- Xiong, Y., et al. Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization. BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).
- Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models. Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).
- Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
- Saha, T., et al. Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking. Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).
- Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. A quantitative study of growth cone filopodial extension. J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).
- Mogilner, A., Rubinstein, B.
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells. PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).
- Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus. J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).
- Korobova, F., Svitkina, T. Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis. Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).
- Cheadle, L., Biederer, T. The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization. J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).
- Tarnok, K., et al. A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility. Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).
- Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images. Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).
- Costantino, S., et al.
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).
