从多个小鼠组织分离中间丝状蛋白以研究与老化相关的翻译后修饰
Summary
在这种方法中，我们提出了从多个小鼠组织快速高效地分离中间丝（IF）蛋白质的生物化学方法。分离的IF可用于通过质谱法和其他生化测定法研究翻译后修饰的变化。
Abstract
中间丝（IFs）与肌动蛋白丝和微管一起形成细胞骨架 – 每个细胞的关键结构元件。正常功能的IF为细胞提供机械和应激弹性，而功能失调的IF细胞骨架损害细胞健康，并与许多人类疾病相关。翻译后修饰（PTM）对生理变化和应激条件下的IF动力学进行了严格的调节。因此，监测IFM的PTM签名变化的能力可以有助于在细胞损伤期间作为应激反应者的IF系统的更好的功能理解和最终调节。然而，由超过70个个体基因编码并以组织依赖性方式表达的大量IF蛋白质是排除不同PTM相对重要性的主要挑战。为此，可以监测IF蛋白上的PTMs的方法在生物体层面上，而不是孤立的家庭成员，可以加速这一领域的研究进展。在这里，我们提出生物化学方法，从9种不同的小鼠组织（脑，心脏，肺，肝，小肠，大肠，胰腺，肾脏和）分离IF蛋白的总，洗涤剂可溶性和去污剂抗性分数脾）。我们进一步展示了通过使用裂解基质和不同小鼠组织的自动均质化来快速分离IF蛋白的优化方案。自动化方案对于在具有高样品体积的实验中（例如涉及多个动物和实验组的疾病模型）中的IF进行分析是有用的。所得样品可用于各种下游分析，包括基于质谱的PTM分析。利用这些方法，我们提供新的数据，显示不同小鼠组织（脑和肝）中的IF蛋白在其表达方面发生平行变化老龄化期间的PTMs。
Introduction
IF是一系列蛋白质，在人类中由73个基因编码并分为六种主要类型：I-IV型是细胞质（ 例如上皮和毛发角蛋白（K），肌细胞结蛋白，神经丝，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和别的）; V型是核脂肪;并且VI型是眼镜1中的IF。在其分子组织方面，IF蛋白质具有三个共同的结构域：高度保守的螺旋线圈“棒”结构域，以及球状“头”和“尾”结构域。 IF蛋白质四聚体组装形成短丝前体，其最终并入成熟细丝中，其形成涉及机械保护的动态细胞骨架和核结构结构2 ，应激感测3,4 ，调节转录5和生长以及其他关键细胞功能“> 1,6,7 。
由IF基因错义突变引起的许多人类疾病的存在突出了IF系统的功能重要性，包括神经病，肌病，皮肤脆性障碍，代谢功能障碍和早衰症候群8 。一些IF基因突变不会引起疾病进展的倾向，如肝脏疾病中的简单上皮角蛋白9 。后者是由于上皮中的IF的临界应力保护功能。一般来说，IF在基础条件下是最丰富的细胞蛋白，但在各种类型的应激10中进一步强烈诱导。例如，最近对线虫线虫的蛋白质组范围变化进行的研究表明，多个IF被高度上调并且易于聚集在有机体老化11,12 。由于维持适当的IF结构对于细胞对各种形式的应力10的抵抗是至关重要的，所以IF聚集也可能导致衰老过程中的功能下降。然而，缺乏在不同组织中进行压力检测多种哺乳动物IF蛋白的有机体水平的研究。
IF是高度动态的结构，可以适应蜂窝需求。例如，角蛋白经历可溶性（非丝状）和不溶性（丝状）蛋白质池13之间的生物合成非依赖性循环。在正常的生理条件下，约5％的K8 / K18总库可以在无洗涤剂的缓冲液中提取，相比之下可以溶解在非离子型洗涤剂Nonidet P-40中的约20％，这是与Triton- X100 14 ， </s> 15 。在有丝分裂期间，简单型上皮K8和K1814的溶解度显着增加，这在表皮角蛋白中不太明显，但在波形蛋白和其他III型IF蛋白15,16 中更为明显。 IF蛋白的溶解性质通过磷酸化来进行严格调控，磷酸化是针对灯丝重排和溶解度的关键的翻译后修饰（PTM）17,18,19,20。大多数IF受到保护地点的多个PTM的广泛监管，导致功能变化17 。
这种方法的目的是引入新的IF领域的研究人员进行生物化学提取和多个小鼠组织中IF蛋白研究的分析方法。具体盟军，我们专注于使用高盐提取方法分离IF蛋白，并通过质谱法和PTM靶向抗体评估PTMs的变化。这些方法基于以前发布的程序21，但包括用于提取不同IF蛋白类型的修饰，以揭示通过IF家族调节的常见机制。例如，特定赖氨酸残基处的K8乙酰化调节细丝组织，而超乙酰化促进K8不溶性和聚集体形成22 。最近的全球蛋白质组学分析研究还发现，大多数组织特异性IF蛋白质也是乙酰化的靶标，大多数IF乙酰化位点被限制在高度保守的杆结构域。这突出表明需要适合IF系统的全局分析的方法。我们还介绍了使用Opti自动均质化从多组织分离IF蛋白的快速方法大小溶解基质。所得制剂适用于通过质谱法和其他方法进行下游PTM分析。
Protocol
该协议是根据北卡罗来纳大学的机构动物保护和使用委员会（IACUC）批准和执行的。 准备工作制备Triton-X缓冲液（1％Triton X-100,5mM乙二胺四乙酸（EDTA）），在磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4中调高体积）。制成500mL：将Triton X-100和500mM EDTA各5mL搅拌至490mL PBS（pH7.4）中。在4℃下储存Triton-X缓冲溶液。 制备高盐缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.6,140mM NaCl，1.5M KCl，5mM EDTA，0.5％Triton X-100，在双?…
Representative Results
一种使用裂解基质从多个小鼠组织中高度盐提取IF蛋白的新的快速方法。 在这里修饰了分离大部分中间丝蛋白部分与上皮组织的传统方法25,26以包括9种不同的器官和更快速的组织溶解过程。虽然传统方法需要3个手动均质步骤，但修改过程只有1个手动均质步骤，可以?…
Discussion
使IF蛋白的生物化学表征的方法可用于了解哺乳动物系统中的许多病理生理现象，因为IF蛋白既是细胞和组织应激的标志物和调节剂。目前的方法背后的原理是基于20世纪70年代和80年代开发的初步程序，从细胞和组织中分离，分离和重建IF蛋白，一般采用低盐和高盐溶液和Triton-X100洗涤剂25,30,31,32 ， 33,34,35 。对于支持IF蛋白生化分离的研究的历史见解，请参见最近的评论<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到NIH R01 DK110355，DK093776 [NTS]，DK102450 [NTS]和P30 DK034987 [向UNC-Chapel Hill]的支持。作者感谢Deekshita Ramanarayanan协助qPCR和免疫印迹实验。
Materials
| Dynabeads Protein G | ThermoFisher Scientific | 10009 | immunoprecipitation beads |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for buffers |
| Purelink RNA mini kit | ThermoFisher Scientific | 12183018 | RNA extraction from tissue |
| Purelink DNAse set | ThermoFisher Scientific | 12185010A | on column DNA digestion |
| Dynamag-2 | ThermoFisher Scientific | 12321D | magnet for use with dynabeads |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24592 | mass spectrometry-compatible gel stain |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32106 | for use in western blot |
| High Capacity cDNA reverse transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4368813 | for use in gene expression analysis |
| Proflex 3×32-well PCR System | ThermoFisher Scientific | 4484073 | PCR system |
| PVDF transfer membrane | ThermoFisher Scientific | 88520 | for western blot |
| Power Up SYBR master mix | ThermoFisher Scientific | A25778 | for qPCR analysis |
| RNAlater | ThermoFisher Scientific | AM7020 | solution for tissue storage prior to RNA isolation |
| Novex 4-20% Tris Glycine Gel | ThermoFisher Scientific | XP04205BOX | Precast protein gel |
| Anti-Keratin 8 antibody (TS1) | ThermoFisher Scientific | MA514428 | for western blot detection of K8 |
| Anti-Vimentin | ThermoFisher Scientific | MA511883 | for western blot detection of vimentin |
| Tris Glycine Transfer Buffer (25X) | ThermoFisher Scientific | LC3675 | for wet transfer of protein gels |
| 2X SDS Sample Buffer | ThermoFisher Scientific | LC2676 | for preparing protein gel samples |
| Tris Glycine SDS Running Buffer (10X) | ThermoFisher Scientific | LC26755 | for running protein gels |
| Lysing beads – Matrix D | MP Biomedicals | 116913100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction |
| Lysing beads – Matrix SS | MP Biomedicals | 116921100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-LITE | measurement of protein and nucleic acid |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119 | Automated tissue homogenizer |
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Citazione di questo articolo
Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).