Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Summary

In diesem Verfahren stellen wir biochemische Verfahren zur schnellen und effizienten Isolierung von Zwischenfilament (IF) Proteinen aus mehreren Mausgeweben vor. Isolierte IFs können verwendet werden, um Veränderungen in posttranslationalen Modifikationen durch Massenspektrometrie und andere biochemische Assays zu untersuchen.

Abstract

Zwischenfilamente (IFs) bilden zusammen mit Aktinfilamenten und Mikrotubuli das Zytoskelett – ein kritisches Strukturelement jeder Zelle. Normal funktionierende IFs liefern Zellen mit mechanischer und Belastungsstabilität, während ein dysfunktionelles IF-Zytoskelett die zelluläre Gesundheit beeinträchtigt und mit vielen menschlichen Krankheiten assoziiert wurde. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) kritisieren die IF-Dynamik kritisch als Reaktion auf physiologische Veränderungen und unter Stressbedingungen. Daher kann die Fähigkeit, Änderungen in der PTM-Signatur von IFs zu überwachen, zu einem besseren funktionalen Verständnis und letztlich Konditionierung des IF-Systems als Stress-Responder bei zellulären Verletzungen beitragen. Allerdings ist die große Anzahl von IF-Proteinen, die von über 70 einzelnen Genen codiert und gewebeabhängig ausgedrückt werden, eine große Herausforderung, die relative Bedeutung verschiedener PTMs zu lokalisieren. Zu diesem Zweck werden Methoden, die die Überwachung von PTMs auf IF-Proteinen ermöglichenAuf einer organismusweiten Ebene, anstatt für isolierte Familienmitglieder, kann den Forschungsfortschritt in diesem Bereich beschleunigen. Hier präsentieren wir biochemische Methoden zur Isolierung der gesamten, detergenzlöslichen und detergenzresistenten Fraktion von IF-Proteinen aus 9 verschiedenen Mausgeweben (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Dünndarm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse, Niere und Milz). Wir zeigen weiterhin ein optimiertes Protokoll zur schnellen Isolierung von IF-Proteinen unter Verwendung von Lysing-Matrix und automatisierter Homogenisierung verschiedener Mausgewebe. Das automatisierte Protokoll ist nützlich für die Profilierung von IFs in Experimenten mit hohem Probenvolumen (wie bei Krankheitsmodellen mit mehreren Tieren und experimentellen Gruppen). Die resultierenden Proben können für verschiedene nachgeschaltete Analysen verwendet werden, einschließlich massenspektrometrischer PTM-Profilierung. Unter Verwendung dieser Methoden liefern wir neue Daten, um zu zeigen, dass IF-Proteine ​​in verschiedenen Mausgeweben (Gehirn und Leber) parallele Veränderungen in Bezug auf ihre Expres unterliegenUnd PTMs während des Alterns.

Introduction

IFs sind eine Familie von Proteinen, die beim Menschen von 73 Genen kodiert und in sechs Haupttypen kategorisiert sind: Die Typen I-IV sind zytoplasmatisch ( zB Epithel- und Haarkeratine (K), Myozyten desmin, Neurofilamente, gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), und andere); Typ V sind die nuklearen Lamine; Und Typ VI sind IFs in der Augenlinse ¹ . In Bezug auf ihre molekulare organisation haben IF-Proteine ​​drei gemeinsame Domänen: eine hochkonservierte Coiled-Coil-"Stab" -Domäne und globuläre "Head" und "tail" Domains. Wenn Protein-Tetramere zusammengesetzt werden, um kurze Filamentvorläufer zu bilden, die letztlich in reife Filamente eingebaut werden, die dynamische zytoskeletale und nukleoskeletale Strukturen, die an mechanischem Schutz ² , Stress-Sensing ^{3 , 4} , Regulierung der Transkription ⁵ und Wachstum und anderen kritischen zellulären Funktionen beteiligt sind,"> 1 ^{, 6 , 7} .

Die funktionelle Bedeutung des IF-Systems wird durch die Existenz vieler menschlicher Erkrankungen hervorgerufen, die durch Missense-Mutationen in IF-Genen verursacht werden, einschließlich Neuropathien, Myopathien, Hautzerstörungsstörungen, metabolische Dysfunktionen und vorzeitige Alterungssyndrome ⁸ . Einige IF-Gen-Mutationen verursachen nicht, sondern prädisponieren ihre Träger zur Krankheitsprogression, wie die einfachen epithelialen Keratine in der Lebererkrankung ⁹ . Letzteres ist auf die kritischen Stress-Schutzfunktionen von IFs in Epithelien zurückzuführen. IFs gehören im Allgemeinen zu den am häufigsten vorkommenden zellulären Proteinen unter basalen Bedingungen, sind aber bei verschiedenen Belastungsarten weiter stark induziert ¹⁰ . Zum Beispiel haben neuere Studien, die proteomweite Veränderungen im Nematoden C. elegans untersuchten, gezeigt, dass mehrere IFs hoch hochreguliert und anfällig für Aggregat sindWährend der organisatorischen Alterung ^{11 , 12} . Da die Aufrechterhaltung einer geeigneten IF-Struktur für die zelluläre Resistenz gegenüber verschiedenen Formen von Stress ¹⁰ wesentlich ist, kann die IF-Aggregation auch bei der Alterung zum funktionellen Rückgang beitragen. Allerdings fehlt es an organismalen Studien, die mehrere Säugetier-IF-Proteine ​​über verschiedene Gewebe untersuchen, die sich einer Belastung unterziehen.

IFs sind hochdynamische Strukturen, die sich an zellulare Anforderungen anpassen. Keratine werden beispielsweise einem biosyntheseunabhängigen Zyklus zwischen löslichem (nicht filamentösem) und unlöslichem (filamentösen) Protein-Pool ¹³ unterzogen. Unter normalen physiologischen Bedingungen kann etwa 5% der gesamte K8 / K18-Pool in reinigungsmittelfreiem Puffer extrahiert werden, im Vergleich zu etwa 20%, der im nichtionischen Detergens Nonidet P-40 solubilisiert werden kann, das biochemisch mit Triton- X100 ^{14 ,} </sUp> ¹⁵ Während der Mitose gibt es eine bemerkenswerte Erhöhung der Löslichkeit von einfachem Epithel K8 und K18 ¹⁴ , was bei epidermalen Keratinen weniger offensichtlich ist, aber deutlicher in Vimentin und anderen Typ III IF-Proteinen ^{15 , 16 ist} . Die Löslichkeitseigenschaften von IF-Proteinen werden durch Phosphorylierung, eine Schlüssel-posttranslationale Modifikation (PTM) für die Fadenumlagerung und Löslichkeit ^{17 , 18 , 19 , 20 ,} geregelt. Die meisten IFs unterliegen einer umfangreichen Regulierung durch eine Reihe von PTMs an konservierten Standorten, was zu funktionalen Veränderungen führt.

Der Zweck dieser Methode ist es, Ermittler einzuführen, die neu im IF-Feld sind, um biochemische Extraktion und analytische Methoden für die Untersuchung von IF-Proteinen über mehrere Maus-Gewebe. SpezifischWir konzentrieren uns auf die Isolierung von IF-Proteinen unter Verwendung einer Hochsalz-Extraktionsmethode und Bewertung von Veränderungen in PTMs durch Massenspektrometrie und durch PTM-Targeting-Antikörper. Diese Methoden bauen auf den zuvor veröffentlichten Prozeduren ^{21 auf} , umfassen jedoch Modifikationen zum Extrahieren verschiedener IF-Protein-Typen, um einen gemeinsamen Mechanismus für die Regulierung über die IF-Familie aufzudecken. Beispielsweise reguliert die K8-Acetylierung an einem spezifischen Lysinrest die Filamentorganisation, während die Hyperacetylierung die K8-Unlöslichkeit und die Aggregatbildung ²² fördert. Jüngste globale Proteom-Profiling-Studien haben zusätzlich gezeigt, dass die meisten gewebespezifischen IF-Proteine ​​auch Ziele für die Acetylierung sind und dass die meisten IF-Acetylierungsstellen auf die hoch konservierte Stab-Domäne beschränkt sind. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Methoden, die für die globale Profilierung des IF-Systems geeignet sind. Wir führen auch eine schnelle Methode zur Isolierung von IF-Proteinen aus mehreren Geweben mit automatisierter Homogenisierung in opti einGemischte lysing matrix Die resultierenden Präparate eignen sich für die nachgeschaltete PTM-Analyse über Massenspektrometrie und andere Methoden.

Protocol

Das Protokoll wird gemäß dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina genehmigt und durchgeführt. 1. Vorbereitungen Triton-X-Puffer (1% Triton X-100, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vorbereiten, Volumen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) aufbringen. Um 500 ml zu ergeben: 5 ml Triton X-100 und 500 mM EDTA in 490 ml PBS, pH 7,4, umrühren. Triton-X-Pufferlösung bei 4 ° C aufbewahren. Vorbereitung des Salzsalzes (1…

Representative Results

Eine neue Schnellmethode für die hochsalzbasierte Extraktion von IF-Proteinen aus mehreren Mausgeweben mittels Lysing-Matrix. Die traditionelle Methode 25 , 26 der Isolierung der Masse der Zwischenfilamentproteinfraktion aus Epithelgewebe wurde hier modifiziert, um 9 verschiedene Organe und ein schnelleres Verfah…

Discussion

Methoden, die die biochemische Charakterisierung von IF-Proteinen ermöglichen, können nützlich sein, um zahlreiche pathophysiologische Phänomene in Säugetiersystemen zu verstehen, da IF-Proteine ​​sowohl Marker als auch Modulatoren von Zell- und Gewebedressen sind ²⁹ . Das Prinzip der aktuellen Methode basiert auf den in den 1970er und 1980er Jahren entwickelten Initialverfahren zur Isolierung, Trennung und Rekonstituierung von IF-Proteinen aus Zellen und Geweben, die in der Regel niedri…

Materials

Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	immunoprecipitation beads
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	for buffers
Purelink RNA mini kit	ThermoFisher Scientific	12183018	RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set	ThermoFisher Scientific	12185010A	on column DNA digestion
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent	ThermoFisher Scientific	24592	mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher Scientific	32106	for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit	ThermoFisher Scientific	4368813	for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR system
PVDF transfer membrane	ThermoFisher Scientific	88520	for western blot
Power Up SYBR master mix	ThermoFisher Scientific	A25778	for qPCR analysis
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	for western blot detection of K8
Anti-Vimentin	ThermoFisher Scientific	MA511883	for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X)	ThermoFisher Scientific	LC3675	for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer	ThermoFisher Scientific	LC2676	for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)	ThermoFisher Scientific	LC26755	for running protein gels
Lysing beads – Matrix D	MP Biomedicals	116913100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119	Automated tissue homogenizer