इंटरमीडिएट फिलामेंट प्रोटीन का मल्टीपल माऊस ट्यूस्यूज से अलगाव, एजिंग से जुड़े पोस्ट-ट्रांसजेशनल संशोधनों का अध्ययन
Summary
इस पद्धति में, हम एकाधिक माउस टिश्यू से इंटरमीडिएट फिलामेंट (IF) प्रोटीन के तेजी से और कुशल अलगाव के लिए जैव रासायनिक प्रक्रियाएं पेश करते हैं। अलग-अलग अगर मास स्पेक्ट्रोमेट्री और अन्य जैव रासायनिक एनाल्स द्वारा अनुवाद-परिवर्तन के बाद के परिवर्तनों में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Abstract
इंटरमीडिएट फिलामेंट्स (IF), एक साथ एक्टिन फिलामेंट्स और माइक्रोट्यूब्यूल्स, साइटोस्केलेटन – प्रत्येक सेल का एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक तत्व है। सामान्य कामकाज यदि यांत्रिक और तनाव के साथ कोशिकाओं को प्रदान करता है, जबकि एक बेकार अगर cytoskeleton सेलुलर स्वास्थ्य से समझौता करता है और कई मानव रोगों से जुड़ा हुआ है। पोस्ट-ट्रांसजनल संशोधनों (पीटीएम) गंभीर रूप से शारीरिक परिवर्तन की प्रतिक्रिया में और तनाव की स्थितियों में गतिशीलता को विनियमित करते हैं। इसलिए, पीटीएम हस्ताक्षर में परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता बेहतर कार्यात्मक समझ में योगदान दे सकती है, और अंततः कंडीशनिंग, अगर सेलुलर चोट के दौरान तनाव प्रतिक्रिया के रूप में सिस्टम। हालांकि, बड़ी संख्या में IF प्रोटीन, जो 70 से अधिक व्यक्तिगत जीन द्वारा एन्कोडेड हैं और एक ऊतक-निर्भर तरीके से व्यक्त किए जाते हैं, विभिन्न पीटीएम के सापेक्ष महत्व को व्यवस्थित करने में एक बड़ी चुनौती है। इसके लिए, प्रोटीन पर पीटीएम की निगरानी में सक्षम तरीकोंपरिवार के अलग-अलग सदस्यों के लिए, इस क्षेत्र में अनुसंधान की प्रगति को गति प्रदान कर सकते हैं, बजाय जीव-व्यापी स्तर पर। यहां, हम 9 अलग-अलग माऊस ऊतकों (मस्तिष्क, हृदय, फेफड़े, यकृत, छोटी आंत, बड़ी आंत, अग्न्याशय, गुर्दा और अन्य) से प्रोटीन की कुल, डिटर्जेंट-घुलनशील, और डिटर्जेंट-प्रतिरोधी अंश के अलगाव के लिए जैव रासायनिक विधियां पेश करते हैं। तिल्ली)। हम लेट्स मैट्रिक्स और विभिन्न माउस टिश्यू के स्वचालित होमोजनाइज़ेशन का उपयोग करके IF प्रोटीन के तेजी से अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं। स्वचालित प्रोटोकॉल IFs को उच्च नमूना मात्रा (जैसे कई जानवरों और प्रायोगिक समूहों को शामिल करने वाले रोग मॉडल में) के प्रयोगों में प्रयोग करने के लिए उपयोगी है। परिणामी नमूनों का उपयोग विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जिसमें जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित पीटीएम प्रोफाइलिंग शामिल है। इन विधियों का उपयोग करते हुए, हम नए डेटा प्रदान करते हैं कि यह दिखाने के लिए कि विभिन्न माऊस ट्यूस (मस्तिष्क और यकृत) में प्रोटीन के जरिए उनके व्यय के संबंध में समानांतर बदलाव आते हैंउम्र बढ़ने के दौरान सायन स्तर और पीटीएम
Introduction
यदि प्रोटीन का एक परिवार है कि मनुष्यों में 73 जीनों द्वारा एन्कोड किया गया है और छह प्रमुख प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है: प्रकार I-IV cytoplasmic हैं ( जैसे उपकला और बाल केरातिंस (के), मायोसाइट डेसिन, न्यूरोफिलामेंट्स, ग्लियाल फेब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) और दूसरे); प्रकार V परमाणु लैंप हैं; और प्रकार VI IF हैं आंख लेंस 1 में । अपने आणविक संगठन के संदर्भ में, IF प्रोटीन के तीन सामान्य डोमेन हैं: एक उच्च संरक्षित कुंडली-कुंडल "रॉड" डोमेन, और गोलाकार "सिर" और "पूंछ" डोमेन। यदि प्रोटीन टेट्रामर्स छोटे रेशा के अग्रदूतों को इकट्ठा करते हैं, जो अंततः परिपक्व तंतुओं में शामिल होते हैं जो कि मैकेनिकल प्रोटेक्शन 2 में शामिल गतिशील साइटोस्केलेटल और न्यूक्लूसोकेलल स्ट्रक्चर होते हैं, तनाव 3 , 4 , ट्रांसक्रिप्शन 5 के विनियमन और विकास और अन्य महत्वपूर्ण सेलुलर फ़ंक्शन"> 1 , 6 , 7
यदि IF प्रणाली का कार्यात्मक महत्व न्यूरोपाथी, माइओपैथी, त्वचा की नाजुकता विकार, चयापचय संबंधी दोष, और समय से पहले उम्र बढ़ने के लक्षणों सहित, जीन में मिस एन्टेसेशन के कारण कई मानव रोगों के अस्तित्व से प्रकाश डाला गया है। कुछ अगर जीन उत्परिवर्तन का कारण नहीं होता है, लेकिन अपने कैरियर को बीमारी की प्रगति के लिए प्राथमिकता देता है, जैसे कि यकृत रोग 9 में सरल उपकला केराटिन बाद में एपिथेलिया में आईएफ के महत्वपूर्ण तनाव-सुरक्षात्मक कार्यों के कारण होता है। यदि सामान्य रूप से मूलभूत स्थितियों के तहत सबसे अधिक प्रचुर मात्रा में सेलुलर प्रोटीन होते हैं, लेकिन 10 विभिन्न प्रकार के तनावों के दौरान इसे और अधिक मजबूती से प्रेरित किया जाता है। उदाहरण के लिए, नीमेटोड सी एलिगेंस में प्रोटीम-विस्तृत परिवर्तनों का मूल्यांकन करते हुए हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कई IFs अत्यधिक अपरिवर्तित और aggregatiपर जीवित उम्र बढ़ने के दौरान 11 , 12 चूंकि एक उचित आचरण संरचना के रखरखाव सेलुलर प्रतिरोध के लिए विभिन्न प्रकार के तनाव के लिए आवश्यक है 10 , अगर एकत्रीकरण उम्र बढ़ने के दौरान कार्यात्मक गिरावट में भी योगदान दे सकता है। हालांकि, बहुत से स्तनधारी की जांच कर रहे जीव-स्तर के अध्ययन तनाव से गुजर रहे विभिन्न ऊतकों में प्रोटीन की कमी है।
यदि अत्यधिक गतिशील संरचनाएं हैं जो सेलुलर मांगों को पूरा करने के लिए अनुकूल हैं केरातिन्स, उदाहरण के लिए, घुलनशील (गैर-फिलामेंट) और अघुलनशील (फिलामेंट) प्रोटीन पूल 13 के बीच एक बायोसिंथेसिस-स्वतंत्र साइक्लिंग से गुजरता है। सामान्य शारीरिक परिस्थितियों में लगभग 5% कुल के 8 / के 18 पूल को डिटर्जेंट मुक्त बफर में निकाला जा सकता है, जो लगभग 20% की तुलना में गैर-आयनिक डिटर्जेंट नॉनिडेेट पी -40 में किया जा सकता है, जो ट्राइटॉन- एक्स 100 14 , </sअप> 15 मिटिसोस के दौरान साधारण प्रकार के एपिथेलियल के 8 और के 18 14 की विलेयता में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है, जो एपिडर्मल केरैटिन में कम स्पष्ट है, लेकिन अधिक वेंटिन और अन्य प्रकार के प्रोटीन 15 , 16 प्रोटीन में अधिक स्पष्ट है। IF प्रोटीन के विलेयता गुणों को फॉस्फोरायलेशन द्वारा कसकर विनियमित किया जाता है, जो फिलामेंट पुनर्व्यवस्था और विलेयता 17 , 18 , 1 9 , 20 के लिए एक महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशन सुधार (पीटीएम) है। अधिकांश यदि संरक्षित साइट्स पर कई पीटीएम द्वारा व्यापक विनियमन से गुजरना पड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप कार्यात्मक परिवर्तन 17
इस पद्धति का उद्देश्य उन जांचकर्ताओं को पेश करना है, जो IF फील्ड में नए हैं और जैव रासायनिक निष्कर्षण और कई माऊस टिशूओं में आईएफ प्रोटीन के अध्ययन के लिए विश्लेषणात्मक तरीके हैं। विशिष्टसहयोगी, हम उच्च-नमक निष्कर्षण पद्धति और पीटीएम में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से और पीटीएम-लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी द्वारा परिवर्तनों का मूल्यांकन करते हुए प्रोटीनों के अलगाव पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इन तरीकों से पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं पर 21 का निर्माण होता है, लेकिन अगर परिवार में IF परिवार के विनियमन के लिए सामान्य तंत्र को उजागर करने के लिए अलग-अलग प्रोटीन प्रकार निकालने के लिए संशोधनों में शामिल होता है। उदाहरण के लिए, विशिष्ट लाइसिन अवशेष पर के 8 एसिटिलेशन, फिलामेंट संगठन को विनियमित करते हैं, जबकि हाइपरैकिटिलेशन K8 विसंरचना और कुल गठन 22 को बढ़ावा देता है। हाल ही में वैश्विक प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग अध्ययनों से पता चला है कि अधिकांश ऊतक-विशिष्ट अगर प्रोटीन एसिटिलेशन के लिए लक्ष्य भी हैं और अधिकतर एसिटिलेशन साइटें अत्यधिक संरक्षित रॉड डोमेन तक ही सीमित हैं। यह IF सिस्टम की वैश्विक रूपरेखा के लिए उपयुक्त तरीकों की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है। हम ओटी में स्वचालित होमोजनाइजेशन का उपयोग करते हुए कई ऊतकों से प्रोटीन को अलग करने की एक त्वरित विधि भी पेश करते हैंमैट लयिंग मैट्रिक्स परिणामस्वरूप तैयारी मास स्पेक्ट्रोमेट्री और अन्य विधियों के माध्यम से डाउनस्ट्रीम PTM विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन को सक्षम करने वाले तरीके स्तनधारी प्रणालियों में कई पैथोफिज़ियोलॉजिकल घटनाओं को समझने में उपयोगी हो सकते हैं, क्योंकि प्रोटीन सेलुलर और टिशू तनाव 29 के मा?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच अनुदान NIH R01 DK110355, DK0 9 3776 [एनटीएस], डीके 102450 [एनटीएस] और पी 30 डीके 0434 9 7 [यूएनसी-चैपल हिल] द्वारा समर्थित था। लेखक qPCR और पश्चिमी दाग प्रयोगों के साथ सहायता के लिए दीक्षितता रामानारायणन का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Dynabeads Protein G | ThermoFisher Scientific | 10009 | immunoprecipitation beads |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for buffers |
| Purelink RNA mini kit | ThermoFisher Scientific | 12183018 | RNA extraction from tissue |
| Purelink DNAse set | ThermoFisher Scientific | 12185010A | on column DNA digestion |
| Dynamag-2 | ThermoFisher Scientific | 12321D | magnet for use with dynabeads |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24592 | mass spectrometry-compatible gel stain |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32106 | for use in western blot |
| High Capacity cDNA reverse transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4368813 | for use in gene expression analysis |
| Proflex 3×32-well PCR System | ThermoFisher Scientific | 4484073 | PCR system |
| PVDF transfer membrane | ThermoFisher Scientific | 88520 | for western blot |
| Power Up SYBR master mix | ThermoFisher Scientific | A25778 | for qPCR analysis |
| RNAlater | ThermoFisher Scientific | AM7020 | solution for tissue storage prior to RNA isolation |
| Novex 4-20% Tris Glycine Gel | ThermoFisher Scientific | XP04205BOX | Precast protein gel |
| Anti-Keratin 8 antibody (TS1) | ThermoFisher Scientific | MA514428 | for western blot detection of K8 |
| Anti-Vimentin | ThermoFisher Scientific | MA511883 | for western blot detection of vimentin |
| Tris Glycine Transfer Buffer (25X) | ThermoFisher Scientific | LC3675 | for wet transfer of protein gels |
| 2X SDS Sample Buffer | ThermoFisher Scientific | LC2676 | for preparing protein gel samples |
| Tris Glycine SDS Running Buffer (10X) | ThermoFisher Scientific | LC26755 | for running protein gels |
| Lysing beads – Matrix D | MP Biomedicals | 116913100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction |
| Lysing beads – Matrix SS | MP Biomedicals | 116921100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-LITE | measurement of protein and nucleic acid |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119 | Automated tissue homogenizer |
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