Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all'invecchiamento

Summary

In questo metodo, presentiamo procedure biochimiche per l'isolamento rapido ed efficace delle proteine ​​del filamento intermedio (IF) dai tessuti multipli del topo. Gli IF isolati possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nelle modificazioni post-traslazionali mediante spettrometria di massa e altri dosaggi biochimici.

Abstract

I filamenti intermedi (IFs), insieme ai filamenti e ai microtubuli attinici, formano il citoscheletro – elemento strutturale critico di ogni cellula. IFs funzionanti normalmente forniscono le cellule con meccaniche e resistenza allo stress, mentre un citoscheletro IF disfunzionale compromette la salute cellulare e è stato associato a molte malattie umane. Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) regolano criticamente la dinamica IF in risposta a cambiamenti fisiologici e in condizioni di stress. Pertanto, la capacità di monitorare i cambiamenti nella firma PTM di IF può contribuire a una migliore comprensione funzionale e, in ultima analisi, del sistema IF come risposta responsabile dello stress durante le lesioni cellulari. Tuttavia, il gran numero di proteine ​​IF, codificate da più di 70 geni individuali e espresse in maniera dipendente dal tessuto, è una sfida importante nell'eliminare l'importanza relativa di diversi PTM. A tal fine, metodi che consentono il monitoraggio di PTM sulle proteine ​​IFSu un livello organizzativo, piuttosto che per i membri isolati della famiglia, può accelerare il progresso della ricerca in questo settore. Qui presentiamo metodi biochimici per l'isolamento della frazione totale resistente al detergente e resistente ai detergenti delle proteine ​​IF da 9 diversi tessuti del topo (cervello, cuore, polmone, fegato, piccolo intestino, intestino, pancreas, rene e milza). Inoltre dimostriamo un protocollo ottimizzato per il rapido isolamento delle proteine ​​IF utilizzando la matrice di lysing e l'omogeneizzazione automatizzata di diversi tessuti del topo. Il protocollo automatizzato è utile per profilare gli IF in esperimenti con un elevato volume di campioni (come ad esempio nei modelli di malattia che coinvolgono più animali e gruppi sperimentali). I campioni risultanti possono essere utilizzati per varie analisi a valle, tra cui la profilazione PTM basata sulla spettrometria di massa. Utilizzando questi metodi, forniamo nuovi dati per dimostrare che le proteine ​​IF nei diversi tessuti del topo (cervello e fegato) subiscono cambiamenti paralleli rispetto al loro espressoLivelli di sione e PTM durante l'invecchiamento.

Introduction

Gli IF sono una famiglia di proteine ​​che sono umane codificate da 73 geni e sono classificate in sei tipi principali: i tipi I-IV sono citoplasmatici ( ad esempio cheratine epiteliali e capelli (K), miocite desmin, neurofilamenti, proteina acido fibrillare gliale (GFAP) e altri); Tipo V sono i lamini nucleari; E il tipo VI sono IF nella lente di occhio ¹ . In termini di organizzazione molecolare, le proteine ​​IF hanno tre domini comuni: un dominio "rod" a spirale a spirale altamente conservato e domini globali "testa" e "tail". IF si assemblano per formare precursori di filamenti brevi, che vengono infine incorporati in filamenti maturi che formano strutture dinamiche citoscheletriche e nucleoscheletriche coinvolte nella protezione meccanica ² , stress sensing ^{3 , 4} , regolazione della trascrizione ⁵ e crescita e altre funzioni cellulari critiche"> 1 ^{, 6 , 7} .

L'importanza funzionale del sistema IF è evidenziata dall'esistenza di molte malattie umane causate da mutazioni missense nei geni IF, comprese le neuropatie, le miopatie, i disturbi della fragilità cutanea, le disfunzioni metaboliche e le sindromi di invecchiamento precoce ⁸ . Alcune mutazioni del gene IF non causano, ma predispongono i loro carrier alla progressione della malattia, come le semplici keratine epiteliali nella malattia epatica ⁹ . Quest'ultima è dovuta alle funzioni critiche di protezione dello stress di IF in epitelio. Le IF sono in genere tra le proteine ​​cellulari più abbondanti in condizioni basali, ma sono inoltre fortemente indotte durante vari tipi di stress ¹⁰ . Ad esempio, studi recenti che valutano le variazioni del proteome nel nematode C. elegans hanno dimostrato che IF multipli sono altamente regolati e soggetti ad aggregatiDurante l'invecchiamento organico ^{11 , 12} . Poiché la manutenzione di una corretta struttura IF è essenziale per la resistenza cellulare a varie forme di stress ¹⁰ , l'aggregazione IF può anche contribuire al declino funzionale durante l'invecchiamento. Tuttavia, mancano gli studi sul livello organico che esaminano più proteine ​​di mammiferi IF nei diversi tessuti sottoposti a stress.

Le IF sono strutture altamente dinamiche che si adattano per soddisfare le esigenze cellulari. Le cheratine, ad esempio, subiscono un ciclismo indipendente dalla biosintesi tra il pool solubile (non filamentoso) e quello insolubile (filamentoso) ¹³ . In normali condizioni fisiologiche, circa il 5%, la piscina totale K8 / K18 può essere estratta in tampone privo di detersivo, rispetto a circa il 20% che può essere solubilizzata nel detergente non ionico Nonidet P-40, biochimicamente paragonabile a Triton- X100 ^{14 ,} </sUp> ¹⁵ . Durante la mitosi c'è un notevole aumento della solubilità dell'epitelio di tipo semplice K8 e K18 ¹⁴ , che è meno evidente nelle cheratine epidermiche ma più evidente in vimentin e in altre proteine ​​di tipo III IF ^{15 e 16} . Le proprietà di solubilità delle proteine ​​IF sono fortemente regolate dalla fosforilazione, una modifica post-traduzionale chiave (PTM) per il riarrangiamento del filamento e la solubilità ^{17 , 18 , 19 , 20} . La maggior parte degli IF sono sottoposti ad una vasta regolazione da parte di un certo numero di PTM nei siti conservati, con conseguenti modifiche funzionali ¹⁷ .

Lo scopo di questo metodo è introdurre gli investigatori che sono nuovi al campo IF per l'estrazione biochimica e metodi analitici per lo studio delle proteine ​​IF attraverso diversi tessuti del topo. SpecificaCi concentriamo sull'isolamento delle proteine ​​IF usando un metodo di estrazione ad alto sale e la valutazione dei cambiamenti nei PTM tramite spettrometria di massa e da anticorpi di targeting PTM. Questi metodi si basano su procedure precedentemente pubblicate21 ma includono modifiche per estrarre diversi tipi di proteine ​​IF per scoprire il meccanismo comune per la regolazione nella famiglia IF. Ad esempio, l'acetilazione K8 in un residuo di lisina specifico regola l'organizzazione del filamento, mentre l'iperacetilazione favorisce l'insolubilità di K8 e la formazione di aggregati ²² . I recenti studi di profilom proteomici globali hanno inoltre evidenziato che la maggior parte delle proteine ​​IF del tessuto-specifico sono anche obiettivi per l'acetilazione e che la maggior parte dei siti di acetilazione IF sono limitati al dominio asta altamente conservato. Ciò evidenzia la necessità di metodi adatti alla profilazione globale del sistema IF. Introduciamo anche un rapido metodo di isolamento delle proteine ​​IF dai tessuti multipli utilizzando l'omogeneizzazione automatizzata in optiMatrice di lysazione. I preparati risultanti sono adatti per l'analisi PTM a valle tramite spettrometria di massa e altri metodi.

Protocol

Il protocollo è approvato e svolto in conformità con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord. 1. Preparativi Preparare il tampone Triton-X (1% Triton X-100, 5 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA), portare il volume in soluzione salina fosfata (PBS), pH 7,4). Per ottenere 500 mL: mescolare 5 mL ciascuno di Triton X-100 e 500 mM EDTA in 490 mL di PBS, pH 7,4. Conservare la soluzione tampone Triton-X a 4 ° C. </…

Representative Results

Un nuovo metodo rapido per l'estrazione elevata di proteine ​​IF dai diversi tessuti del topo usando la matrice di lysazione. Il metodo tradizionale 25 , 26 di isolare la maggior parte della frazione proteica filamentosa intermedia dal tessuto epiteliale è stato modificato qui per includere 9 diversi orga…

Discussion

I metodi che permettono la caratterizzazione biochimica delle proteine ​​IF possono essere utili per comprendere numerosi fenomeni patofisiologici nei sistemi mammiferi, in quanto le proteine ​​IF sono entrambi marcatori e modulatori dello stress cellulare e del tessuto ²⁹ . Il principio dietro il metodo attuale si basa sulle procedure iniziali sviluppate negli anni '70 e '80 per isolare, separare e ricostituire proteine ​​IF dalle cellule e dai tessuti, generalmente impiegand…

Materials

Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	immunoprecipitation beads
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	for buffers
Purelink RNA mini kit	ThermoFisher Scientific	12183018	RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set	ThermoFisher Scientific	12185010A	on column DNA digestion
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent	ThermoFisher Scientific	24592	mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher Scientific	32106	for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit	ThermoFisher Scientific	4368813	for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR system
PVDF transfer membrane	ThermoFisher Scientific	88520	for western blot
Power Up SYBR master mix	ThermoFisher Scientific	A25778	for qPCR analysis
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	for western blot detection of K8
Anti-Vimentin	ThermoFisher Scientific	MA511883	for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X)	ThermoFisher Scientific	LC3675	for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer	ThermoFisher Scientific	LC2676	for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)	ThermoFisher Scientific	LC26755	for running protein gels
Lysing beads – Matrix D	MP Biomedicals	116913100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119	Automated tissue homogenizer