Isolering av mellomproduktfilamentproteiner fra flere musvæsker til studie aldringsassosierte posttranslatoriske modifikasjoner

Summary

I denne metoden presenterer vi biokjemiske prosedyrer for rask og effektiv isolering av mellomfilament (IF) proteiner fra flere musevev. Isolerte IF'er kan brukes til å studere endringer i posttranslasjonelle modifikasjoner ved massespektrometri og andre biokjemiske analyser.

Abstract

Mellomliggende filamenter (IFs), sammen med aktinfilamenter og mikrotubuli, danner cytoskelettet – et kritisk strukturelt element i hver celle. Normal funksjon IFs gir celler med mekanisk og spenningsfasthet, mens en dysfunksjonell IF-cytoskelett kompromitterer cellulær helse og har vært assosiert med mange humane sykdommer. Post-translational modifikasjoner (PTM) regulerer kritisk IF-dynamikk som respons på fysiologiske endringer og under stressforhold. Derfor kan evnen til å overvåke endringer i PTM-signaturen til IF'er bidra til en bedre funksjonell forståelse, og i siste instans, av IF-systemet som en stressrespons under cellulær skade. Imidlertid er det store antallet IF-proteiner, som er kodet av over 70 individuelle gener og uttrykt på en vevsavhengig måte, en stor utfordring ved å sortere ut den relative betydningen av forskjellige PTM. Til dette formål, metoder som muliggjør overvåking av PTM på IF-proteinerPå et organisasjonsnivå, i stedet for isolerte medlemmer av familien, kan akselerere forskningsprosessene på dette området. Her presenterer vi biokjemiske metoder for isolering av total, vaskemiddeloppløselig og vaskemiddelresistent fraksjon av IF-proteiner fra 9 forskjellige musevev (hjerne, hjerte, lunge, lever, tynntarm, tykktarmen, bukspyttkjertelen, nyrene og milt). Vi demonstrerer videre en optimalisert protokoll for rask isolering av IF-proteiner ved å bruke lyseringsmatrise og automatisert homogenisering av forskjellige musevev. Den automatiserte protokollen er nyttig for profiling av IFs i eksperimenter med høyt prøvevolum (for eksempel i sykdomsmodeller som involverer flere dyr og eksperimentelle grupper). De resulterende prøvene kan benyttes for forskjellige nedstrømsanalyser, inkludert massespektrometribasert PTM-profilering. Ved hjelp av disse metodene, gir vi nye data som viser at IF-proteiner i forskjellige musevev (hjernen og leveren) gjennomgår parallelle endringer med hensyn til deres uttrykkSionnivåer og PTM under aldring.

Introduction

IF er en familie av proteiner som er kodet av 73 gener og er kategorisert i seks hovedtyper: typene I-IV er cytoplasmatiske ( f.eks. Epitel- og hårkeratiner (K), myocyt desmin, nevrofilamenter, glialfibrillær surt protein (GFAP), og andre); Type V er kjernen laminer; Og type VI er IF i øyelinsen ¹ . Når det gjelder deres molekylære organisasjon, har IF-proteiner tre vanlige domener: et høyt konsentrert coiled-coil "rod" -domene, og globulære "head" og "tail" -domener. HVIS proteinetetramerer samles for å danne korte filamentprekursorer, som til slutt er innarbeidet i modne filamenter som former dynamiske cytoskeletale og nukleoskeletale strukturer involvert i mekanisk beskyttelse ² , spenningsregistrering ^{3 , 4} , regulering av transkripsjon ⁵ og vekst og andre kritiske cellulære funksjoner"> 1 ^{, 6 , 7} .

Den funksjonelle betydningen av IF-systemet er fremhevet av eksistensen av mange humane sykdommer forårsaket av missens-mutasjoner i IF-gener, inkludert nevropatier, myopatier, hudfrekvensforstyrrelser, metabolske dysfunksjoner og for tidlig aldringssyndrom ⁸ . Noen IF-genmutasjoner forårsaker ikke, men predisponerer deres bærere til sykdomsprogresjon, som for eksempel enkle epithelialkeratiner i leversykdom ⁹ . Sistnevnte skyldes de kritiske stressbeskyttende funksjonene til IF i epithelia. IFs generelt er blant de mest omfattende cellulære proteiner under basale forhold, men er ytterligere sterkt indusert under ulike typer stress ¹⁰ . For eksempel viste nylige studier som evaluerte proteom-brede endringer i nematoden C. elegans at flere IF er høyt oppregulert og tilbøyelig til aggregatPå under organisatorisk aldring ^{11 , 12} . Siden vedlikehold av en skikkelig IF-struktur er avgjørende for cellulær motstand mot forskjellige former for stress ¹⁰ , kan IF-aggregering også bidra til funksjonell nedgang under aldring. Imidlertid mangler studier på organisasjonsnivå som undersøker flere pattedyr IF-proteiner på tvers av forskjellige vev under stress.

IF er svært dynamiske strukturer som tilpasser seg for å oppfylle mobilkrav. Keratiner, for eksempel, gjennomgår en biosyntese-uavhengig sykling mellom oppløselig (ikke-filamentøs) og uoppløselig (filamentøs) proteinbasseng ¹³ . Under normale fysiologiske forhold ca. 5% kan det totale K8 / K18 bassenget ekstraheres i vaskemiddelfri buffer i forhold til ca. 20% som kan oppløses i det ikke-ioniske vaskemiddelet Nonidet P-40, som er biokjemisk sammenlignbart med Triton- X100 ^{14 ,} </sOpp> ¹⁵ . Under mitose er det en merkbar økning i oppløseligheten av enkeltypepitel K8 og K1814, noe som er mindre tydelig i epidermale keratiner, men mer tydelig i vimentin og andre type III IF-proteiner ^{15 , 16} . Opløselighetsegenskaper for IF-proteiner reguleres tett ved fosforylering, en nøkkel posttranslasjonell modifisering (PTM) for filamentomretting og oppløselighet ^{17 , 18 , 19 , 20} . De fleste IF'er gjennomgår omfattende regulering av en rekke PTMer på konserverte steder, noe som resulterer i funksjonelle endringer ¹⁷ .

Formålet med denne metoden er å introdusere etterforskere som er nye for IF-feltet til biokjemisk utvinning og analysemetoder for studier av IF-proteiner på tvers av flere musevev. SpesifikkAlliert, fokuserer vi på isolering av IF-proteiner ved hjelp av en høysalt-ekstraksjonsmetode og vurdering av endringer i PTMs via massespektrometri og ved PTM-målende antistoffer. Disse metodene bygger på tidligere publiserte prosedyrer ^21, men inkluderer modifikasjoner for ekstraksjon av forskjellige IF-proteintyper for å avdekke felles mekanisme for regulering over IF-familien. For eksempel regulerer K8-acetylering ved en bestemt lysinrest filamentorganisasjon, mens hyperacetylering fremmer K8-uløselighet og aggregatdannelse ²² . Nyere globale proteomiske profileringsstudier har i tillegg avdekket at de fleste vevsspesifikke IF-proteiner også er mål for acetylering, og at de fleste IF-acetyleringssteder er begrenset til det høyt konserverte stangdomenet. Dette understreker behovet for metoder som er egnet for global profilering av IF-systemet. Vi introduserer også en rask metode for å isolere IF-proteiner fra flere vev ved hjelp av automatisert homogenisering i optikkMisert lyseringsmatrise. De resulterende preparater er egnet for nedstrøms PTM analyse via massespektrometri og andre metoder.

Protocol

Protokollen er godkjent og utført i samsvar med Institutt for dyrepleie og bruk (IACUC) ved University of North Carolina. 1. Forberedelser Klargjør Triton-X-buffer (1% Triton X-100, 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), oppsaml volum i fosfatbuffert saltvann (PBS), pH 7,4). For å gjøre 500 ml: rør 5 ml hver av Triton X-100 og 500 mM EDTA i 490 ml PBS, pH 7,4. Oppbevar Triton-X bufferløsning ved 4 ° C. Fremstill høy saltbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM ED…

Representative Results

En ny rask metode for høy saltbasert ekstraksjon av IF-proteiner fra flere musvev som bruker lyseringsmatrise. Den tradisjonelle metode 25 , 26 for isolering av hovedparten av mellomfilamentproteinfraksjonen fra epitelvev ble modifisert her for å inkludere 9 forskjellige organer og en raskere prosedyre for vevsl…

Discussion

Metoder som muliggjør biokjemisk karakterisering av IF-proteiner kan være nyttige for å forstå mange patofysiologiske fenomener i pattedyrsystemer, siden IF-proteiner er både markører og modulatorer av cellulært og vevsstress ²⁹ . Prinsippet bak den nåværende metoden er basert på de første prosedyrene utviklet på 1970- og 1980-tallet for å isolere, separere og rekonstruere IF-proteiner fra celler og vev, generelt ved bruk av lav- og høysaltløsninger og Triton-X100-vaskemiddel <sup …

Materials

Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	immunoprecipitation beads
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	for buffers
Purelink RNA mini kit	ThermoFisher Scientific	12183018	RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set	ThermoFisher Scientific	12185010A	on column DNA digestion
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent	ThermoFisher Scientific	24592	mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher Scientific	32106	for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit	ThermoFisher Scientific	4368813	for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR system
PVDF transfer membrane	ThermoFisher Scientific	88520	for western blot
Power Up SYBR master mix	ThermoFisher Scientific	A25778	for qPCR analysis
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	for western blot detection of K8
Anti-Vimentin	ThermoFisher Scientific	MA511883	for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X)	ThermoFisher Scientific	LC3675	for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer	ThermoFisher Scientific	LC2676	for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)	ThermoFisher Scientific	LC26755	for running protein gels
Lysing beads – Matrix D	MP Biomedicals	116913100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119	Automated tissue homogenizer