Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

Summary

Neste método, apresentamos procedimentos bioquímicos para isolamento rápido e eficiente de proteínas de filamento intermediário (IF) a partir de tecidos de múltiplos ratos. IFs isoladas podem ser usadas para estudar mudanças em modificações pós-translacionais por espectrometria de massa e outros ensaios bioquímicos.

Abstract

Filamentos intermediários (IFs), juntamente com filamentos de actina e microtúbulos, formam o citoesqueleto – um elemento estrutural crítico de cada célula. Funcionamento normal IFs fornecer células com resistência mecânica e estresse, enquanto um citoesqueleto disfuncional IF compromete a saúde celular e tem sido associado a muitas doenças humanas. As modificações pós-translacionais (PTMs) regulam criticamente a dinâmica de IF em resposta a mudanças fisiológicas e sob condições de estresse. Portanto, a capacidade de monitorar as mudanças na assinatura PTM de IFs pode contribuir para uma melhor compreensão funcional e, em última instância condicionamento, do sistema IF como um stress responder durante a lesão celular. No entanto, o grande número de proteínas IF, que são codificadas por mais de 70 genes individuais e expressas de forma dependente de tecidos, é um grande desafio para classificar a importância relativa de diferentes PTMs. Para o efeito, os métodos que permitem a monitorização de PTMs em proteínas IFEm nível de organismo, e não para membros isolados da família, pode acelerar o progresso da pesquisa nesta área. Aqui, apresentamos métodos bioquímicos para o isolamento da fração total, detergente-solúvel e resistente ao detergente de proteínas IF de 9 diferentes tecidos de ratos (cérebro, coração, pulmão, fígado, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas, rim e baço). Demonstrámos ainda um protocolo optimizado para o isolamento rápido de proteínas IF utilizando matriz de lise e homogeneização automatizada de diferentes tecidos de ratinho. O protocolo automatizado é útil para perfilar IFs em experimentos com alto volume de amostra (como em modelos de doença envolvendo múltiplos animais e grupos experimentais). As amostras resultantes podem ser utilizadas para várias análises a jusante, incluindo perfis PTM de espectrometria de massa. Utilizando estes métodos, fornecemos novos dados para mostrar que as proteínas IF em diferentes tecidos de rato (cérebro e fígado) sofrem mudanças paralelas com respeito à sua expressãoE PTMs durante o envelhecimento.

Introduction

As IFs são uma família de proteínas que nos seres humanos são codificadas por 73 genes e categorizadas em seis tipos principais: os tipos I a IV são citoplasmáticos ( por exemplo, queratina epitelial e capilar (K), desmina de miócitos, neurofilamentos, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e outros); Tipo V são as laminas nucleares; E tipo VI são IFs na lente ocular ¹ . Em termos de sua organização molecular, as proteínas IF têm três domínios comuns: um domínio "var" de bobina enrolada altamente conservado e domínios globulares "cabeça" e "cauda". Os tetrâmeros de proteína IF se unem para formar precursores de filamentos curtos, que são finalmente incorporados em filamentos maduros que formam estruturas citoesqueléticas dinâmicas e nucleoesqueléticas envolvidas na proteção mecânica ² , sensação de estresse ^{3 , 4} , regulação da transcrição ⁵ e crescimento e outras funções celulares críticas"> 1 ^{, 6 , 7} .

A importância funcional do sistema IF é evidenciada pela existência de muitas doenças humanas causadas por mutações missense em genes IF, incluindo neuropatias, miopatias, doenças de fragilidade cutânea, disfunções metabólicas e síndromes de envelhecimento prematuro ⁸ . Algumas mutações no gene IF não causam, mas predispõem seus portadores à progressão da doença, como as queratinas epiteliais simples na doença hepática ⁹ . Este último é devido às funções críticas de proteção ao estresse das IF no epitélio. As IFs em geral estão entre as proteínas celulares mais abundantes sob condições basais, mas são ainda fortemente induzidas durante vários tipos de estresse ¹⁰ . Por exemplo, estudos recentes que avaliam alterações de todo o proteoma no nematóide C. elegans demonstraram que as IFs múltiplas estão altamente reguladas e propensas a agregaçõesDurante o envelhecimento do organismo ^{11 , 12} . Uma vez que a manutenção de uma estrutura IF adequada é essencial para a resistência celular a várias formas de stress ¹⁰ , a agregação IF também pode contribuir para o declínio funcional durante o envelhecimento. Contudo, estudos de nível organizacional que examinam múltiplas proteínas de mamífero IF em diferentes tecidos submetidos a estresse estão faltando.

IFs são estruturas altamente dinâmicas que se adaptam para atender demandas celulares. As queratinas, por exemplo, sofrem uma ciclagem independente da biossíntese entre o pool protéico solúvel (não filamentoso) e insolúvel (filamentoso) ¹³ . Em condições fisiológicas normais, pode extrair-se aproximadamente 5% do pool K8 / K18 total em tampão sem detergente, em comparação com aproximadamente 20% que pode ser solubilizado no detergente não iónico Nonidet P-40, que é bioquimicamente comparável a Triton- X100 ^{14 ,} </sUp> ¹⁵ . Durante a mitose, há um aumento notável na solubilidade do K8 e K1814 do epitélio de tipo simples, que é menos aparente nas queratinas epidérmicas, mas mais aparente na vimentina e em outras proteínas IF do tipo III ^15,16 . As propriedades de solubilidade das proteínas IF são fortemente reguladas pela fosforilação, uma modificação pós-translacional chave (PTM) para rearranjo de filamentos e solubilidade ^{17 , 18 , 19 , 20} . A maioria das IF sofre regulação extensiva por um número de PTMs em locais conservados, resultando em alterações funcionais ¹⁷ .

A finalidade deste método é introduzir os investigadores que são novos ao campo do IF à extração bioquímica e aos métodos analíticos para o estudo de proteínas de FI através dos tecidos múltiplos do rato. EspecíficoAliado, focamos no isolamento de proteínas IF usando um método de extração de alto sal e avaliação de mudanças em PTMs por espectrometria de massa e por anticorpos dirigidos contra PTM. Estes métodos baseiam-se nos procedimentos previamente publicados ^21, mas incluem modificações para extrair diferentes tipos de proteína IF para descobrir o mecanismo comum de regulação em toda a família IF. Por exemplo, a acetilação de K8 num resíduo de lisina específico regula a organização do filamento, enquanto que a hiperacetilação promove a insolubilidade do K8 e a formação de agregados ²² . Recentes estudos globais de perfil proteómico revelaram adicionalmente que a maioria das proteínas IF específicas de tecido são também alvos para acetilação e que a maioria dos locais de acetilação de IF estão confinados ao domínio de haste altamente conservado. Isso destaca a necessidade de métodos adequados para o perfil global do sistema IF. Nós também introduzimos um método rápido de isolar IF proteínas de múltiplos tecidos usando homogeneização automatizada em optiMatriz de lise. As preparações resultantes são adequadas para análise PTM a jusante por espectrometria de massa e outros métodos.

Protocol

O protocolo é aprovado e realizado de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte. 1. Preparações Preparar tampão Triton-X (Triton X-100 a 1%, ácido etilenodiaminotetraacético 5 mM (EDTA), aumentar o volume em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4). Para preparar 500 mL: agitar 5 mL cada de Triton X-100 e EDTA 500 mM em 490 mL de PBS, pH 7,4. Armazenar a solução tampão Triton-X a 4 ° C. Preparar tampão…

Representative Results

Um novo método rápido para a alta extração salina de proteínas IF de múltiplos tecidos de ratos usando matriz de lise. O método tradicional 25 , 26 de isolar a maior parte da fracção de proteína de filamento intermediário a partir do tecido epitelial foi aqui modificado para incluir 9 órgãos diferente…

Discussion

Métodos que permitem a caracterização bioquímica de proteínas IF podem ser úteis para compreender numerosos fenômenos fisiopatológicos em sistemas de mamíferos, uma vez que as proteínas IF são marcadores e moduladores do estresse celular e tecidual ²⁹ . O princípio subjacente ao método actual baseia-se nos procedimentos iniciais desenvolvidos nas décadas de 1970 e 1980 para isolar, separar e reconstituir as proteínas IF das células e tecidos, empregando geralmente soluções salin…

Materials

Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	immunoprecipitation beads
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	for buffers
Purelink RNA mini kit	ThermoFisher Scientific	12183018	RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set	ThermoFisher Scientific	12185010A	on column DNA digestion
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent	ThermoFisher Scientific	24592	mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher Scientific	32106	for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit	ThermoFisher Scientific	4368813	for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR system
PVDF transfer membrane	ThermoFisher Scientific	88520	for western blot
Power Up SYBR master mix	ThermoFisher Scientific	A25778	for qPCR analysis
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	for western blot detection of K8
Anti-Vimentin	ThermoFisher Scientific	MA511883	for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X)	ThermoFisher Scientific	LC3675	for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer	ThermoFisher Scientific	LC2676	for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)	ThermoFisher Scientific	LC26755	for running protein gels
Lysing beads – Matrix D	MP Biomedicals	116913100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119	Automated tissue homogenizer