Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

Summary

В этом методе мы представляем биохимические процедуры для быстрого и эффективного выделения промежуточных филаментных (IF) белков из нескольких тканей мыши. Изолированные IFs можно использовать для изучения изменений посттрансляционных модификаций с помощью масс-спектрометрии и других биохимических анализов.

Abstract

Промежуточные филаменты (IFs) вместе с актиновыми филаментами и микротрубочками образуют цитоскелет – критический структурный элемент каждой клетки. Нормальные функционирующие ИФ обеспечивают клетки механической и стрессовой устойчивостью, в то время как нефункциональный цитоскелет IF ставит под угрозу здоровье клеток и связан со многими заболеваниями человека. Посттрансляционные модификации (ПТМ) критически регулируют динамику ПЧ в ответ на физиологические изменения и в стрессовых условиях. Таким образом, способность контролировать изменения в сигнатуре ПТФ ПЧ может способствовать лучшему функциональному пониманию и, в конечном счете, кондиционированию системы ПЧ в качестве ответчика на стресс при клеточном повреждении. Тем не менее, большое количество IF-белков, которые кодируются более чем 70 отдельными генами и экспрессируются тканезависимым образом, является основной проблемой при определении относительной важности различных ПТМ. С этой целью методы, которые позволяют контролировать ПТМ на белках ПЧНа общесистемном уровне, а не на отдельных членов семьи, может ускорить прогресс исследований в этой области. Здесь мы представляем биохимические методы для выделения полной, детергент-растворимой и устойчивой к моющим средствам фракции IF-белков из 9 различных тканей мыши (мозг, сердце, легкие, печень, тонкая кишка, толстая кишка, поджелудочная железа, почка и селезенка). Далее мы демонстрируем оптимизированный протокол для быстрой изоляции IF-белков с использованием лизирующей матрицы и автоматической гомогенизации различных тканей мыши. Автоматизированный протокол полезен для профилирования ИФ в экспериментах с большим объемом выборки (например, в моделях болезней с участием нескольких животных и экспериментальных групп). Полученные в результате образцы могут быть использованы для различных анализов ниже по течению, включая масс-спектрометрическое профилирование PTM. Используя эти методы, мы предоставляем новые данные, чтобы показать, что белки IF в различных тканях мыши (мозг и печень) подвергаются параллельным изменениям в отношении их экспрессийУровня и ПТМ во время старения.

Introduction

IFS – это семейство белков, которые у людей кодируются 73 генами и подразделяются на шесть основных типов: типы I-IV являются цитоплазматическими ( например, эпителиальные и волосяные кератины (K), миоцит-десмин, нейрофиламенты, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и другие); Тип V – ядерные слои; И тип VI являются ПЧ в глазной линзе ¹ . С точки зрения их молекулярной организации, белки IF имеют три общие области: высококонсервативный спиральный «стержневой» домен и шаровые «голова» и «хвостовой» домен. IF-тетрамеры белка собираются с образованием коротких нитевидных предшественников, которые в конечном счете внедряются в зрелые волокна, которые формируют динамические цитоскелетные и нуклеоскелетные структуры, участвующие в механической защите ² , чувствительность к стрессу ^{3 , 4} , регуляцию транскрипции ⁵ и рост и другие критические клеточные функции"> 1 ^{, 6 , 7} .

Функциональное значение IF-системы подчеркивается наличием многих заболеваний человека, вызванных missense мутациями в IF-генах, включая невропатии, миопатии, расстройства хрупкости кожи, метаболические дисфункции и синдромы преждевременного старения ⁸ . Некоторые мутации гена IF не вызывают, но предрасполагают их носителей к прогрессированию болезни, таким как простые эпителиальные кератины при болезни печени ⁹ . Последнее связано с критическими стресс-защитными функциями ИФ в эпителии. IFS в общем случае являются одними из наиболее распространенных клеточных белков в базальных условиях, но дополнительно сильно индуцируются при различных типах стресса ¹⁰ . Например, недавние исследования, оценивающие изменения в широком диапазоне протеомов у нематод C. elegans, показали, что множественные IFs сильно активируются и склонны к агрегатамВо время старения организма ^{11 , 12} . Поскольку поддержание надлежащей структуры IF важно для устойчивости клеток к различным формам стресса ¹⁰ , агрегация IF также может способствовать функциональному снижению во время старения. Однако исследования на организменном уровне, изучающие множественные IF-протеины млекопитающих в разных тканях, подвергающихся стрессу, отсутствуют.

IFs – это высокодинамичные структуры, которые адаптируются к требованиям сотовой связи. Кератины, например, подвергаются независимой от биосинтеза циклизации между растворимым (неволокнистым) и нерастворимым (нитевидным) пулом ¹³ протеинов. При нормальных физиологических условиях приблизительно 5% общий объем пула K8 / K18 может быть экстрагирован в буфере без моющих средств по сравнению с приблизительно 20%, который может быть солюбилизирован в неионном детергенте Nonidet P-40, который биохимически сравним с Triton- X100 ^{14 ,} </sВверх> ¹⁵ . Во время митоза наблюдается заметное увеличение растворимости эпителия K8 и K18 ¹⁴ простого типа, которое менее выражено в эпидермальных кератинах, но более выражено у виментина и других IF-белков III типа ^{15 , 16} . Свойства растворимости IF-белков жестко регулируются путем фосфорилирования, ключевой посттрансляционной модификации (PTM) для перегруппировки филаментов и их растворимости ^{17 , 18 , 19 , 20} . Большинство ПЧ подвергаются широкому регулированию рядом ПТМ на консервативных участках, что приводит к функциональным изменениям ¹⁷ .

Цель этого метода заключается в том, чтобы ввести исследователей, которые являются новичками в области ИФ, к биохимическим экстракционным и аналитическим методам исследования IF-протеинов в нескольких тканях мыши. КонкретныйМы сосредотачиваемся на выделении белков IF, используя метод экстракции с использованием соли и оценку изменений в PTM с помощью масс-спектрометрии и PTM-нацеливающих антител. Эти методы основаны на ранее опубликованных процедурах ^21, но включают модификации для извлечения различных типов белка IF, чтобы выявить общий механизм регуляции в IF-семействе. Например, ацетилирование K8 в определенном лизиновом остатке регулирует организацию нитей, тогда как гиперацетилирование способствует нерастворимости K8 и образованию агрегатов ²² . Недавние глобальные исследования протеомного профилирования дополнительно показали, что большинство тканеспецифичных IF-белков также являются мишенями для ацетилирования и что большинство сайтов ацетилирования IF ограничено высококонсервативным доменом палочек. Это подчеркивает необходимость в методах, подходящих для глобального профилирования системы IF. Мы также вводим быстрый метод выделения белков IF из нескольких тканей с использованием автоматической гомогенизации в optiЛизиновая матрица. Полученные препараты пригодны для последующего анализа ПТМ с помощью масс-спектрометрии и других методов.

Protocol

Протокол одобрен и выполняется в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC) в Университете Северной Каролины. 1. Препараты Приготовьте буфер Triton-X (1% Triton X-100, 5 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), добавьте объем в забуференн…

Representative Results

Новый быстрый метод для высокой экстракции на основе солей IF-белков из нескольких тканей мыши с использованием лизирующей матрицы. Традиционный метод 25 , 26 выделения больш…

Discussion

Методы, которые позволяют биохимическую характеристику IF-белков, могут быть полезны для понимания многочисленных патофизиологических явлений в системах млекопитающих, поскольку IF-белки являются маркерами и модуляторами клеточного и тканевого стресса ²⁹ . Принцип, лежащи…

Materials

Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	immunoprecipitation beads
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	for buffers
Purelink RNA mini kit	ThermoFisher Scientific	12183018	RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set	ThermoFisher Scientific	12185010A	on column DNA digestion
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent	ThermoFisher Scientific	24592	mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher Scientific	32106	for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit	ThermoFisher Scientific	4368813	for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR system
PVDF transfer membrane	ThermoFisher Scientific	88520	for western blot
Power Up SYBR master mix	ThermoFisher Scientific	A25778	for qPCR analysis
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	for western blot detection of K8
Anti-Vimentin	ThermoFisher Scientific	MA511883	for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X)	ThermoFisher Scientific	LC3675	for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer	ThermoFisher Scientific	LC2676	for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)	ThermoFisher Scientific	LC26755	for running protein gels
Lysing beads – Matrix D	MP Biomedicals	116913100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119	Automated tissue homogenizer