Isolering av intermediära filamentproteiner från flera musvävnader för att studera åldringsrelaterade posttranslationella modifieringar

Summary

I denna metod presenterar vi biokemiska förfaranden för snabb och effektiv isolering av mellanfilament (IF) proteiner från flera musvävnader. Isolerade IF kan användas för att studera förändringar i posttranslationella modifieringar genom masspektrometri och andra biokemiska analyser.

Abstract

Mellanliggande filament (IF), tillsammans med aktinfilament och mikrotubuli, bildar cytoskeletten – ett kritiskt strukturellt element i varje cell. Normal funktion IFs ger celler med mekanisk och spänningsfasthet, medan en dysfunktionell IF-cytoskelett äventyrar cellulär hälsa och har associerats med många mänskliga sjukdomar. Post-translationella modifieringar (PTM) reglerar IF-dynamiken kritiskt på grund av fysiologiska förändringar och stressförhållanden. Därför kan förmågan att övervaka förändringar i PTM-signaturen av IFs bidra till en bättre funktionell förståelse, och slutligen konditionering, av IF-systemet som en stressrespons under cellulär skada. Emellertid är det stora antalet IF-proteiner, som kodas av över 70 individuella gener och uttryckta på vävnadsberoende sätt, en stor utmaning för att sortera ut den relativa betydelsen av olika PTM. För det ändamålet, metoder som möjliggör övervakning av PTM på IF-proteinerPå en organismövergripande nivå, snarare än för isolerade familjemedlemmar, kan påskynda forskningens framsteg på detta område. Här presenterar vi biokemiska metoder för isolering av den totala, tvättmedelslösliga och tvättmedelsbeständiga fraktionen av IF-proteiner från 9 olika musvävnader (hjärna, hjärta, lung, lever, tunntarmen, tjocktarmen, bukspottkörteln, njuren och mjälte). Vi demonstrerar vidare ett optimerat protokoll för snabb isolering av IF-proteiner genom att använda lyseringsmatris och automatiserad homogenisering av olika musvävnader. Det automatiska protokollet är användbart för profilering av IFs i experiment med hög provvolym (såsom i sjukdomsmodeller som involverar flera djur och experimentella grupper). De resulterande proven kan användas för olika nedströmsanalyser, innefattande masspektrometribaserad PTM-profilering. Genom att använda dessa metoder tillhandahåller vi nya data för att visa att IF-proteiner i olika musvävnader (hjärna och lever) genomgår parallella förändringar med avseende på deras uttryckSionnivåer och PTM under åldrandet.

Introduction

IFs är en familj av proteiner som kodas av människor hos 73 gener och kategoriseras i sex huvudtyper: typerna I-IV är cytoplasmatiska ( t ex epitel- och hårkeratiner (K), myocyt desmin, neurofilament, glialfibrillärt surt protein (GFAP), och andra); Typ V är nukleära laminer; Och typ VI är IF i ögonlinsen ¹ . När det gäller deras molekylära organisation har IF-proteiner tre vanliga domäner: en högt konserverad domän med spolad spole "rod" och globala domäner "huvud" och "svans". IF-proteintetramerer monteras för att bilda korta trådprekursorer, vilka slutligen införlivas i mogna filament som bildar dynamiska cytoskeletala och nukleoskeletala strukturer som är involverade i mekaniskt skydd ² , spänningsavkänning ^{3 , 4} , reglering av transkription ⁵ och tillväxt och andra kritiska cellulära funktioner"> 1 ^{, 6 , 7} .

IF-systemets funktionella betydelse framhävs av förekomsten av många mänskliga sjukdomar orsakade av missensmutationer i IF-gener, inklusive neuropatier, myopatier, hudbräckningsstörningar, metaboliska dysfunktioner och för tidigt åldrande syndrom ⁸ . Några IF-genmutationer orsakar inte, men predisponerar deras bärare till sjukdomsprogression, såsom enkla epithelialkeratiner i leversjukdom ⁹ . Det senare beror på de kritiska stressskyddande funktionerna hos IF i epitel. IFs i allmänhet är bland de vanligast förekommande cellulära proteinerna under basala betingelser, men induceras vidare starkt under olika typer av stress ¹⁰ . Exempelvis visade nyligen studier som utvärderar proteombranta förändringar i nematoden C. elegans att flera IF är högt uppreglerade och benägna att aggregeraPå under organismens åldrande ^{11 , 12} . Eftersom underhåll av en riktig IF-struktur är väsentlig för cellulär resistans mot olika former av stress ¹⁰ kan IF-aggregering också bidra till den funktionella nedgången under åldring. Emellertid saknas studier på organismer nivå som undersöker flera däggdjurs-IF-proteiner över olika vävnader som utsätts för stress.

IF är högdynamiska strukturer som anpassar sig för att möta cellulära krav. Keratiner genomgår exempelvis en biosyntes-oberoende cykling mellan löslig (icke-trådformig) och olöslig (trådformig) proteinpool ¹³ . Under normala fysiologiska förhållanden kan cirka 5% den totala K8 / K18 poolen extraheras i tvättfri buffert, jämfört med ca 20% som kan lösas i det nonjoniska diskmedelet Nonidet P-40, vilket är biokemiskt jämförbart med Triton- X100 ^{14 ,} </sUpp> ¹⁵ . Under mitos finns en märkbar ökning av lösligheten hos epitel K8 och K18 ¹⁴ av enkeltyp, vilket är mindre uppenbart i epidermala keratiner men mer uppenbart i vimentin och andra typ III IF-proteiner ^{15 , 16} . Löslighetsegenskaper för IF-proteiner regleras tätt genom fosforylering, en nyckel efter translationell modifiering (PTM) för filamentomläggning och löslighet ^{17 , 18 , 19 , 20} . De flesta IFs genomgår omfattande reglering av ett antal PTM på konserverade platser, vilket resulterar i funktionella förändringar ¹⁷ .

Syftet med denna metod är att introducera utredare som är nya på IF-området för biokemisk extraktion och analysmetoder för studier av IF-proteiner över flera musvävnader. SpecifikAllierade fokuserar vi på isolering av IF-proteiner med hjälp av en extraktionsmetod med hög salt och bedömning av förändringar i PTM genom masspektrometri och PTM-riktande antikroppar. Dessa metoder bygger på tidigare publicerade procedurer ²¹ men innefattar modifieringar för att extrahera olika IF-proteintyper för att avslöja gemensam mekanism för reglering över IF-familjen. Exempelvis reglerar K8-acetylering vid en specifik lysinrest en filamentorganisation, medan hyperacetylering främjar K8-olöslighet och aggregatbildning ²² . Nya globala proteom profileringsstudier har dessutom visat att de flesta vävnadsspecifika IF-proteiner också är mål för acetylering och att de flesta IF-acetyleringsställen är begränsade till den starkt konserverade stångdomänen. Detta belyser behovet av metoder som är lämpliga för global profilering av IF-systemet. Vi introducerar också en snabb metod för att isolera IF-proteiner från flera vävnader med hjälp av automatiserad homogenisering i optiMiserad lyseringsmatris. De resulterande preparaten är lämpliga för nedströms PTM-analys via masspektrometri och andra metoder.

Protocol

Protokollet godkänns och utförs i enlighet med Institutionen för djurvård och användningskommitté (IACUC) vid University of North Carolina. 1. Förberedelser Bered Triton-X-buffert (1% Triton X-100, 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), höj volymen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4). För att göra 500 ml: rör om 5 ml vardera av Triton X-100 och 500 mM EDTA i 490 ml PBS, pH 7,4. Förvara Triton-X buffertlösning vid 4 ° C. Framställ hög saltbuffert (10 mM Tris-HCl, pH …

Representative Results

En ny snabb metod för hög saltbaserad extraktion av IF-proteiner från flera musvävnader med användning av lysningsmatris. Den traditionella metoden 25 , 26 för att isolera huvuddelen av den mellanliggande filamentproteinfraktionen från epitelvävnad modifierades här för att inkludera 9 olika organ och ett…

Discussion

Metoder som möjliggör biokemisk karakterisering av IF-proteiner kan vara användbara för att förstå många patofysiologiska fenomen i däggdjursystem, eftersom IF-proteiner är både markörer och modulatorer av cellulär och vävnadsspänning ²⁹ . Principen bakom den nuvarande metoden är baserad på de initiala procedurer som utvecklats på 1970-talet och 1980-talet för att isolera, separera och rekonstruera IF-proteiner från celler och vävnader, som i allmänhet använder låg- och hö…

Materials

Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	immunoprecipitation beads
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	for buffers
Purelink RNA mini kit	ThermoFisher Scientific	12183018	RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set	ThermoFisher Scientific	12185010A	on column DNA digestion
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent	ThermoFisher Scientific	24592	mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher Scientific	32106	for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit	ThermoFisher Scientific	4368813	for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR system
PVDF transfer membrane	ThermoFisher Scientific	88520	for western blot
Power Up SYBR master mix	ThermoFisher Scientific	A25778	for qPCR analysis
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	for western blot detection of K8
Anti-Vimentin	ThermoFisher Scientific	MA511883	for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X)	ThermoFisher Scientific	LC3675	for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer	ThermoFisher Scientific	LC2676	for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)	ThermoFisher Scientific	LC26755	for running protein gels
Lysing beads – Matrix D	MP Biomedicals	116913100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119	Automated tissue homogenizer