Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all&#39;interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

Tom Shani; Moshe Levy; Adrian Israelson

doi:10.3791/55676

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Articolo metodologico

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all'interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

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DOI:

10.3791/55676

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16 maggio 2017

Tom Shani¹ , Moshe Levy¹ , Adrian Israelson¹^,²

¹Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, ²The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell'importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP.

Abstract

Il trasporto nucleocitoplasmatico si riferisce all'importazione e all'esportazione di grandi molecole dal nucleo cellulare. Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra la sclerosi laterale amyotrofica (ALS) e le alterazioni del percorso nucleocitoplasmatico. L'ALS è una malattia neurodegenerativa che colpisce i neuroni motori e che porta alla paralisi e, infine, alla morte, in media di 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono sporadici, privi di qualsiasi legame genetico apparente, ma il 10% viene ereditato in maniera dominante. Recentemente, le espansioni di ripetizione di esanucleotidi (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati come una causa genetica di ALS e demenza frontotemporale (FTD). Importante, diversi gruppi hanno recentemente proposto che queste mutanti influenzino il trasporto nucleocitoplasmatico. Questi studi hanno mostrato in gran parte l'esito finale e le manifestazioni causate dagli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano disfunzioni del trasporto nucleare intempo reale. Di conseguenza, solo la carenza nucleocitoplasmatica di trasporto può essere determinata, soprattutto a causa di un'elevata espressione o di inserimento proteico esogeno.

Questo protocollo descrive un nuovo e molto sensibile dosaggio per valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Questo viene eseguito usando un inibitore dell'esportin, consentendo così alla navetta GFP di entrare solo nel nucleo. Per convalidare il dosaggio, sono state utilizzate le ripetizioni dei dipeptidi tradotte da C9orf72 HRE, poli (GR) e poli (PR), che sono state precedentemente mostrate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmico. Utilizzando il saggio descritto, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico e la capacità di diversi fattori di salvarlo (anche parzialmente) di un nucleo nucleotiplasmaticoPuò essere determinato il difetto di risposta.

Introduzione

Il complesso dei pori nucleari (NPC) controlla l'importazione e l'esportazione di grandi molecole in e fuori dal nucleo delle cellule. Contrariamente alle piccole molecole, che possono entrare nel nucleo senza regola ¹ , il trasporto di molecole più grandi è fortemente controllato dal NPC. Queste grandi molecole, come le proteine e l'RNA, associano fattori di trasporto, comprese le importazioni e le esportazioni, da importare ed esportare dal nucleo ² . Per essere importato, le proteine devono contenere un piccolo motivo peptidico, generalmente chiamato un segnale di loc....