Vi demonstrerer en analyse for at analysere de miljømæssige og genetiske signaler, der påvirker parringsadfærd i frugtfly Drosophila melanogaster .
En persons seksuelle drev påvirkes af genotype, erfaring og miljøforhold. Hvordan disse faktorer interagerer med at modulere seksuel adfærd forbliver dårligt forstået. I Drosophila melanogaster påvirker miljømæssige signaler, såsom fødevaretilgængelighed, parringsaktivitet, der tilbyder et traktabelt system til at undersøge mekanismerne, der modulerer seksuel adfærd. I D. melanogaster registreres miljømærker ofte via kemosensoriske gustatoriske og olfaktoriske systemer. Her præsenterer vi en metode til at teste virkningen af miljømæssige kemiske tegn på parringsadfærd. Assayet består af en lille parringsarena indeholdende madmedium og parringpar. Parringsfrekvensen for hvert par overvåges kontinuerligt i 24 timer. Her præsenterer vi anvendeligheden af dette assay for at teste miljøforbindelser fra en ekstern kilde gennem et trykluftsystem samt manipulering af miljøkomponenterne direkte i parringsarenaen. Den uSe et trykluftsystem er især nyttigt til at teste virkningen af meget flygtige forbindelser, mens manipulering af komponenter direkte i parringsarenaen kan være af værdi for at fastslå en forbindelses tilstedeværelse. Dette assay kan tilpasses til at svare på spørgsmål om indflydelse af genetiske og miljømæssige tegn på parringsadfærd og fecundity samt andre reproduktive adfærd hos mænd og kvinder.
Reproduktiv adfærd har typisk høje energikostnader, især for kvinder, der producerer større gameter end mænd og skal omhyggeligt vælge vilkårene for at hæve deres udviklende afkom. På grund af energikostnaden er det ikke overraskende, at reproduktion er forbundet med ernæringsmæssige forhold. Dette gælder i de fleste, om ikke alle, dyr, herunder pattedyr, hvis pubertet kan forsinkes af underernæring, og hvis seksuelle drev kan blive negativt påvirket af fødevarebegrænsning 1 .
Reproduktionen af den genetiske modelorganisme Drosophila melanogaster påvirkes også af næringsbetingelser. Haner domstol på højere niveau i nærværelse af fødevarer flygtige 2 , og kvinder er mere seksuelt modtagelige i nærværelse af gær, et vigtigt næringsstof til ægproduktion og afkom overlevelse 3 , 4 , 5 . Det herEvolutionært konserveret reproduktivt respons på mad giver mulighed for at studere mekanismer, der forbinder miljøtilgængeligheden til seksuel reproduktion i en genetisk tålelig og tidseffektiv organisme. Faktisk har arbejdet i D. melanogaster impliceret insulinvejen som en vigtig regulator for forbindelsen mellem mad og parringsadfærd 6 . Det har også vist, at handlingen med parring selv ændrer kvindens madpræference såvel som de tilhørende kemosensoriske neuroner 7 , 8 , 9 .
Det er klart, at fødevaresignaler påvirker reproduktive adfærd i D. melanogaster . Disse virkninger synes primært at påvirke kvinder, især dem, der allerede har parret 5 . For at teste disse akutte virkninger af miljømæssige forhold kan analysen klassisk anvendt til kvindelig parringsadfærd dogIkke meget passende på grund af de lange afbrydelser mellem parringspisoder. I den klassiske remitterende analyse mødes en jomfru kvinde først med en mand, og isoleres straks og præsenteres med en ny mand 24 til 48 timer senere. Dette klassiske assay er blevet anvendt med stor succes til at identificere komponenter af det mandlige ejakulat, der ændrer den kvindelige opførsel og kvindespørgsmålet 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Den kontinuerlige parringsanalyse demonstreret her er derfor en tilføjelse til klassiske parringsanalyser, der kan anvendes til at studere den akutte virkning af miljømæssige forhold på reproduktionsadfærd.
Ved hjælp af det kontinuerlige assay for parringsadfærd, der forklares her, viste vi tidligere, at et par fluer udsat for gær vil remate sEveral gange over en 24 timers observationsperiode 5 , 19 , 20 , 21 , mens fluer ikke udsættes for mad, vil kun remate en gang 5 . Denne opdagelse kan være uoverskuelig i lyset af en stor del af D. melanogaster litteraturen, der tyder på, at kvinder ikke remitterer i flere dage efter en indledende parring (gennemgået i henvisninger 10 , 11 ). Denne uoverensstemmelse kan dog let forklares ved analysevilkår, hvor en kvinde er isoleret i en til flere dage, før der gives en ny parring mulighed. Hvis parret ikke parrer i denne times lange observationsperiode, er kvinden karakteriseret som ikke modtagelig. Desuden bør den høje parringsfrekvens ikke være overraskende, da dataene fra vildefangne fluer viser, at kvinder indeholder sæd fra 4 til 6 mænd i deres opbevaringsorganer; Således iDicere, at kvinder normalt afholder flere gange 22 , 23 .
Her demonstrerer vi brugen af denne kontinuerlige parringsanalyse for at ophæve, hvordan fluer samler og kombinerer information om miljøforhold for at modulere parringsfrekvens. Dette assay gør det muligt for en at teste et relativt stort antal parringspar til genetiske undersøgelser og for at teste indflydelsen af flygtige og ikke-flygtige miljøindikatorer. Assayet løber typisk i 24 timer, men kan forlænges til 48 timer, hvilket muliggør afprøvning af cykliske miljøindikatorer, såsom den lysmørke (LD) cyklus. Vi demonstrerer denne analyse ved at teste indflydelsen af flygtige signaler fra en gærkultur i et trykluftsystem i kombination med tilgængeligheden af ikke-flygtigt gærnæringsstof i fødevaresubstratet.
Trykluftsystemet pumper kontinuerligt flygtige signaler ind i en parringsarena, der indeholderEt fødevaresubstrat og et testpar (hvis parringsadfærd overvåges). For yderligere at bestemme de særlige forhold, hvorigennem gær påvirker parring, tester vi en større flygtig forbindelse af gær, nemlig eddikesyre 24 , i kombination med et aminosyreindhold, der svarer til gærets i fødevaresubstratet i form af pepton (amino Syrer afledt af enzymatisk fordøjelse af animalske proteiner). Sammen viser disse eksperimenter, hvordan effekten af miljøindikatorer på D. melanogasters parringsadfærd kan testes med dette assay.
Denne protokol beskriver et test for at teste parringsadfærd i løbet af 24 timer, mens du løbende styrer de miljømæssige signaler, som et parretpar er hypotetiseret til at bruge til at bestemme parringsfrekvensen. Det er muligt at øge parringsfrekvensen som reaktion på gærluft leveret gennem et trykluftsystem, når mediet også indeholder gær ( figur 2B ). Derudover kan et lignende svar i parringsfrekvens observeres med et forenklet fødevaremedium indeholdende kun agar-, pepton- og eddikesyrel…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bloomington Drosophila Stock Center for flybestandene; C. Gahr, JT Alkema og S. van Hasselt for deres tidlige forsøg på at udvikle trykluftanalysen; Jasper Bosman for råd om dyrkning af gær Og Rezza Azanchi og Joel Levine for oprindeligt at udvikle time-lapse overvågningen af Drosophila parringsadfærd. JA Gorter blev støttet af et stipendium fra Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Program. Dette arbejde blev delvist støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) (reference: 821.02.020) til JC Billeter.
Cabinet | |||
Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
Power timer | Alecto | TS-121 | |
Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly rearing | |||
Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
Flypad | Flystuff | 59-114 | |
Wild-type flies | Canton-S | ||
Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
Molasses | Flystuff | 62-117 | |
Active dry yeast | Red Star | ||
Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast and pressurised air set-up | |||
Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
Yeast extract | BD | 212750 | |
Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
15 ml tube | Falcon | ||
Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Hot glue | Pattex | ||
Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Analysis | |||
Statistics software | R | lme4 package |