JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Drosophila melanogaster Malpighi tübül epiteli optik Quantification intrasellüler pH floresan genetik olarak kodlanmış pH göstergesi

Published: August 11, 2017
doi:
10.3791/55698
,
1Department of Physiology and Biomedical Engineering,Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Hücresel iyon taşıma kez değerlendirilen hücre içi pH izleyerek (pHben). Genetik olarak kodlanmış pH-göstergeler (GEpHIs) olduğu gibi hücrelerde hücre içi pH optik miktar sağlar. Bu iletişim kuralı aracılığıyla hücresel ex vivo canlı görüntüleme, Drosophila melanogaster Malpighi tübüllerin pHerry ile hücre içi pH miktar detayları, sözde ratiometric genetik olarak kodlanmış pH göstergesi.

Abstract

Epitel iyon taşıma sistemik iyon homeostasis gibi temel hücresel elektrokimyasal gradyan bakımından önemlidir. Hücre içi pH (pHı) birçok iyon taşıyıcılar tarafından etkilenir ve böylece pHben izleme ışınlama etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir araçtır. Modern genetik olarak kodlanmış pH-göstergeler (GEpHIs) optik miktar pHben sağlam hücrelerde, hücre ve hücre altı ölçekte sağlar. Bu iletişim kuralı hücresel pHben yönetmelikte Malpighi tübüllerin (MTs) Drosophila melanogaster ex vivo canlı görüntüleme yoluyla pHerry, sözde ratiometric GEpHI pK, gerçek zamanlı miktar açıklar bir sitozol pH değişiklikleri izlemek için oldukça uygundur. Ayıklanan yetişkin sinek MTs tek hücre katmanı epiteli morfolojik ve fonksiyonel olarak ayrı bölümden oluşmaktadır ve epitel taşıma incelenmesi için erişilebilir ve genetik olarak uysal bir model olarak hizmet verebilir. GEpHIs geleneksel pH duyarlı floresan boyalar ve iyon-seçici elektrot çeşitli avantajlar sunuyor. Uygun organizatörü öğeleri kullanılabilir olması şartıyla GEpHIs farklı hücre popülasyonlarının etiketleyebilirsiniz. Bu etiketleme ex vivo, in vivove doğal olarak heterojen situ hazırlıklar, özellikle kullanışlı olur. GEpHIs da sağlam dokularda ezelî lüzum için tekrarlanan boya tedavi veya doku dışa zamanla pHi miktar izin. Birincil geçerli GEpHIs yanıt olarak doku hasarı sitozolik kapanımlar toplamak ve aşırı ifade oluşturmada eğilimi dezavantajıdır. Bu eksiklikler, çözümleri ve GEpHIs doğal avantajları bu protokolü demiri proton (H+) taşıma ayıklanan sineğin MTs işlevsel olarak ayrı asıl ve Yildiz Seklinde hücrelerdeki değerlendirilmesi ile gösterilen. Teknikleri ve analiz açıklanan çeşitli omurgalı ve omurgasız hazırlıkları için kolayca uyarlanabilir ve tahlil sofistike labs karmaşık iyon akı belirli taşıyıcılar yoluyla belirlenmesi için öğretim ölçeklendirilebilir.

Introduction

Bu protokol miktar hücre içi pH (pHi) bir genetik olarak kodlanmış pH-gösterge (GEpHI) kullanarak açıklamak ve bu yöntem demiri H+ Ulaştırma modeli böcek (ö. değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için hedeftir melanogaster) böbrek yapısı, Malpighi tübül (MT). MTs meyve sineği boşaltım organları hizmet ve işlevsel olarak birkaç anahtar bakımdan1memeli nefron benzer. MTs tübüllerin (anterior ve posteiror) göğüs ve karın anında 2 çift olarak düzenlenir. Tek hücreli epitelyal tüp her MT metabolik olarak aktif asıl hücreleri ile farklı apikal oluşmaktadır (luminal) ve demiri (hemocoel) polarizasyon gibi Yildiz Seklinde hücre ara. Anterior MTs 3 oluşan morfolojik, işlevsel olarak, ve gelişimsel olarak farklı kesimleri, özellikle ilk kesimi, geçiş bölütü ve üreter2‘ ye katıldı salgı ana segment büyümüş. Hücresel ölçekte trans-epitel iyon taşıma Lümen içine bir apikal plazma zarı V-ATPaz3 ve bir alkali-metal/H+ Eşanjör gibi bir demiri Na+-K+tarafından gerçekleştirilir-ATPaz4, içe-doğrultucu K+ kanal5, Na+-Cl−/HCO3− Eşanjör (NDAE1)6ve+Na -K+tahrik-2 Cl− cotransporter (NKCC; Yildiz Seklinde hücre Cl– aracılık ve su taşıma8,9Ncc69)7. Bu karmaşık ama erişilebilir fizyolojik sistemi farklı genetik ve davranışsal toolsets Drosophilaile birleştirildiğinde endojen iyon taşıma mekanizmaları incelenmesi için mükemmel fırsatlar sağlar.

Bu iletişim kuralı için gerekçe epitel iyon taşıma hücreden Tümleştirme davranış ve araçları diğer sistemleri modellemek için ihracat potansiyeli ile çalışmak için genetik olarak yumuşak bir sistemi açıklamak için yapıldı. PHerry10ifadesi, bir füzyon kırmızı pH-duyarlı mCherry13, MTs ve yeşil pH duyarlı süper tutulum pHluorin11,12 (SEpH) türetilmiş bir GEpHI miktar H+ taşıma izni Tek MT hücreleri ile yüksek K+/nigericin kalibrasyon tekniği14. Birçok iyon taşıyıcılar H+ eşdeğerleri geçtiğinizde, hücre içi pHben bir miktar iyon hareketi taşıyıcılar çeşitli yoluyla fonksiyonel bir temsili olarak hizmet vermektedir. Drosophila MT modeli sistem Ayrıca doku özgü transgene15 ve hücresel görüntüleme ve bütün organ deneyleri17 ile birlikte RNA müdahale (RNAi)16 ifade güçlü genetik araçlar sunar , 18 , 19 tübül işlevinin davranışına molekülleri üzerinden dikey entegrasyon ile sağlam bir araç kümesi oluşturmak için. Bu Buna ek olarak diğer birçok protokolün epitel biyoloji, tarihsel olarak bu tür ölçümler üzerinde karmaşık yararlanmıştır olarak değerlendirilmesi ve mikro-diseksiyon, sofistike iyon-seçici elektrot20,21yıldırıcı anlamına gelir, ve pahalı pH duyarlı22 kısıtlayıcı yükleme gereksinimleri ve türdeş olmayan dokularda zavallı hücresel özgüllük ile boya. GEpHIs kapsamlı pHben hücre türleri23çeşitli ölçmek için kullanılmaktadır. Erken dönem çalışmaları doğal pH-duyarlılık, yeşil flüoresan Protein (pHben kültürlü epitel hücreleri24 içinde izlemek için GFP) yararlanan ama son yirmi yılda nöronlar25, glia26, mantar27 kullanılan GEpHIs gördün mü , ve bitki hücreleri28. GAL4/UAS ifade sistem15 ve Drosophila MT fizyolojik erişilebilirliğini genetik yapıları, hücresel hedefleme için potansiyel kombinasyon bu araştırmalar pHiçin ideal bir hazırlık yapmak ben düzenlemesi ve epitel iyon taşıma.

pH yönetmelikben yıllardır okudu ve yaşam için çok önemlidir. Fizyoloji pH yönetmelikben öğretmek ama aynı zamanda gerçekleştirmek için güçlü bir modeli pHi yönetmelik ex vivo ve içinde vivosofistike MT hazırlık kursları sunar. Bu iletişim kuralı miktar H+ hareketinin Drosophila NH4Cl darbe asit tekniği21yükleme kullanarak MT epitel hücrelerinin demiri membran arasında açıklar, ancak pH göstergesi olarak genetik olduğunu kodlanmış, bu yöntemler ve teorik çerçeve herhangi bir hazırlık transgenesis mükellef ve canlı görüntüleme için uygulanabilir.

Protocol

Bu iletişim kuralı tüm adımlarını Mayo Clinic (Rochester, MN) hayvan kullanım yönergelerle uyumlu olmak. 1. yetiştirme fly Zam uçar ve set standart yetiştirme29göre haçlar.Not: Floresan muhabir ifade GAL4/UAS sistem tarafından sıcaklığı ile doğru orantılıdır ve böylece sıcaklık yetiştirme ifade düzeyini değiştirmek için ayarlanabilir. Yüksek ifade düzeyleri genellikle daha iyi bir sinyal / gürültü oranı yol GFP kırmız?…

Representative Results

Sağlıklı doku ve uygun ön MTs tanımlaması bu protokolü başarısı için önemlidir. Diseksiyon sırasında doğrudan dokunmak MTs özen gösterilmelidir ve tek tanıtıcısına onları doğrudan MTs sürükleyici olarak üreter tarafından kırılması (- 4A şekil B) götürecek. MTs düz slayt süpürüldü vardır, tübüllerin mümkün olduğu kadar az değiştirilmesi gereken ve aşırı hareket bu kadar kaçın?…

Discussion

Miktar pHben in başarısında Drosophila MTs tamamen ayıklanan MTs ve montaj ve diseksiyonu (Şekil A – C) kalitesini sağlığı üzerinde bağlıdır. Bu nedenle, dikkatli işleme doku açıklanan zorunludur. Taze PLL içinde kaplı slaytlar önemli ölçüde daha fazla yapışkan olma eğilimi olarak yardım MT montaj daha önce kullandığı eriyik-e doğru kayıyor. Dikkatli montaj da ayrı MT kesimleri (Şekil D) tanımlamas…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NIH DK092408 tarafından desteklenen ve DK100227 MFR. AJR için T32-DK007013 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Julian A.T. Dow Çapar-GAL4 ve c724-GAL4 için teşekkür etmek istiyorum Drosophila stokları. Ayrıca Jacob B. Anderson deneysel sinek haçlar sürdürmek yardım için teşekkür ediyoruz.

Materials

Poly-L-Lysine Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O’Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O’Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochimica. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. . Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Tags

Intracellular PHDrosophila MelanogasterMalpighian Tubule EpitheliaFluorescent Genetically-encoded PH IndicatorBasolateral Proton TransportEpithelial Proton MovementPH RegulationInsect EpithelialMammalian NephronEpithelial CellsIPBSSchneider’s MediumDissectionForceps
check_url/it/55698?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image