Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato

Sommario

Trasporto ionico cellulare spesso può essere valutata attraverso il monitoraggio pH intracellulare (pH_ho). Geneticamente codificato indicatori di pH (GEpHIs) forniscono ottico quantificazione del pH intracellulare in cellule intatte. Questo protocollo dettaglia la quantificazione del pH intracellulare attraverso cellulare ex vivo live-immagini di tubuli malpighiani di Drosophila melanogaster con Bud, un pseudo-raziometrici geneticamente codificato indicatore di pH.

Abstract

Trasporto ionico epiteliale è vitale per omeostasi ionica sistemica così come manutenzione dei gradienti elettrochimici cellulari essenziali. PH intracellulare (pH_io) è influenzato da molti trasportatori di ioni e quindi monitoraggio pH_mi è uno strumento utile per la valutazione dell'attività di trasportatore. Moderno geneticamente codificato-indicatori di pH (GEpHIs) forniscono ottico quantificazione del pH in cellule intatte su scala cellulare e subcellulare. Questo protocollo descrive la quantificazione in tempo reale del pH cellulare_ho regolamento in tubuli malpighiani (MTs) di Drosophila melanogaster attraverso ex vivo live-immagini di Bud, una pseudo-raziometrici GEpHI con un pK_un adatto per tenere traccia di variazioni di pH nel citosol. Estratto Mosca adulta MTs sono composte da sezioni morfologicamente e funzionalmente distinte del epithelia strato unicellulare e può servire come un modello accessibile e geneticamente trattabile per indagine di trasporto epiteliale. GEpHIs offrono parecchi vantaggi sopra le tinture fluorescenti convenzionali pH sensibili ed elettrodi iono-selettivi. GEpHIs possibile etichettare popolazioni distinte delle cellule, purché gli elementi appropriati promotore sono disponibili. Questa marcatura è particolarmente utile nelle ex vivo, in vivoe in situ preparati, che sono intrinsecamente eterogenei. GEpHIs consentono anche la quantificazione del pH_i nei tessuti intatti nel tempo senza necessità di esternalizzazione di trattamento o tessuto di tintura ripetute. Lo svantaggio principale del GEpHIs corrente è la tendenza ad aggregare nelle inclusioni citosoliche in risposta al danno tissutale e costruire la sovra-espressione. Queste carenze, loro soluzioni e vantaggi che essi GEpHIs vengono illustrati nel presente protocollo attraverso la valutazione del trasporto di protoni (H⁺) basolateral nelle cellule principali e stellari funzionalmente distinte di estratti fly MTs. Le tecniche e l'analisi descritta sono facilmente adattabile ad un'ampia varietà di preparazioni di vertebrati e invertebrati, e la raffinatezza del dosaggio può essere scalata da laboratori intricato determinazione del flusso ionico attraverso specifici trasportatori didattici.

Introduzione

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere la quantificazione del pH intracellulare (pH_i) utilizzando un geneticamente codificato-indicatore di pH (GEpHI) e dimostrare come questo metodo può essere utilizzato per valutare basolaterale trasporto di H⁺ in un insetto di modello (D. melanogaster) struttura renale, l'anatomista (MT). MTs servire come gli organi escretori del moscerino della frutta e sono simili ai mammiferi nefrone in diversi aspetti chiave¹. MTs sono disposti come 2 paia di tubuli (anteriori e posteriori) nel torace e l'addome della Mosca. Il tubo epiteliale unicellulare di ogni MT è c....

Protocollo

Tutti i punti in questo protocollo conformi alle linee guida uso animale Mayo Clinic (Rochester, MN).

1. allevamento di volare

1. Vola di rilancio e insieme traverse secondo standard allevamento²⁹.
   Nota: Espressione di reporter fluorescente dal sistema GAL4/UAS è proporzionale alla temperatura e quindi allevamento temperatura può essere regolata per modificare il livello di espressione. Mentre i livelli di espressione alta conducono spesso ad un migliore rapporto segnale-rumore questa circostanza inoltre è associata con aumentati citosolici e organellari aggregati quando usando GFP per fusione proteina fluo....

Risultati

Tessuti sani e un'adeguata identificazione del MTs anteriore sono vitali per il successo del presente protocollo. Durante la dissezione, dovrebbe prestare attenzione a non direttamente tocco il MTs e maniglia unica loro dall'uretere come la MTs di presa direttamente porterà alla rottura (Figura 4A– B). Quando MTs sono spazzate piatta sulla diapositiva, i tubuli devono essere toccati il meno possibile e movimento in eccesso e.......

Discussione

Il successo di quantificazione del pH_sono in Drosophila MTs dipende interamente sulla salute degli estratti MTs e la qualità del montaggio e la dissezione (Figura A – C). Così, la gestione attenta del tessuto come descritto è imperativa. Diapositive appena rivestiti in PLL sostanzialmente aiuti MT di montaggio, come essi tendono ad essere molto più adesivo di diapositive che precedentemente sono stati esposti alla soluzione. Montaggio attenzione sar.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di poli-L-lisina (PLL)	Sigma-Aldrich	P4832	Negozio a 4 ° C, può essere riutilizzato.
Nigericin Sale Sodico	Sigma-Aldrich	N7143	ATTENZIONE: Maneggiare con i guanti. Conservare come aliquote di 20 mM di soluzione madre in DMSO a 4 °C.
Coperchi adesivi per camere di perfusione, dimensioni dell'adesivo 1 mm, diametro e tempi della camera; spessore 9 mm e 0,9 mm, diametro delle porte 1,5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Può essere sostituito secondo necessità per adattarsi al sistema di perfusione.
Sylgard 184 Kit Elastomero Siliconico	Ellsworth Adesivi	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Disponibile da più fornitori.
Helping Hands Supporti per saldatura	Harbor Freight Tools	60501	Disponibile da più fornitori.
Sistema di perfusione aperto alimentato a gravità con controller della valvola, collettore 8 a 1 e riservitori	Strumenti per bioscienze	PS-8S	È possibile utilizzare qualsiasi sistema di perfusione comparabile.
Regolatore di flusso	Warner Instruments	64-0221	Può essere sostituito secondo necessità per adattarsi al sistema di perfusione.
Negozio di 21720024 Schneider's	Medium Fisher Scientific		a 4 ° deg; C in aliquote sterili.
#5 Pinze in acciaio inox	Fine Science Tools	11252-20	Può essere sostituito in base al comfort dello sperimentatore.
Piastra di Petri in polistirene 35 x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	La marca e le dimensioni esatte non sono importanti.
Vetrini per microscopio 75 x 25 mm	Corning Life Sciences	2949-75X25	La marca e le dimensioni esatte possono variare purché i pozzetti di perfusione siano compatibili.
Vetro capillare borosilicato filimentato, diametro interno 1,5 mm, diametro esterno 0,86 mm, spessore 0,32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment non necessario, il vetro può essere sostituito per abbinarsi ai tubi di perfusione e ai pozzetti di perfusione.
Tubo Tygon, ID 1/16", OD 1/8", spessore 1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	Disponibile da più fornitori, può essere sostituito per adattarsi al sistema di perfusione.
Grasso siliconico sottovuoto	Sigma-Aldrich	Z273554	Disponibile da più fornitori.
Pinza per il controllo del flusso in plastica	Fisher Scientific	05-869	Disponibile da diversi fornitori, sterilità non richiesta
Aste di vetro, diametro 5 mm	delphiglass.com	9198	La dimensione esatta è una preferenza personale, più fornitori disponibili
Penna idrofobica PAP	Sigma-Aldrich	Z377821	Disponibile da più fornitori.
Pellicola sigillante	Sigma-Aldrich	P7668	Disponibile da diversi fornitori.
Provetta Falcon da 15 mL	BD Falcon	352096	Disponibile presso diversi fornitori.
Provetta Falcon da 50 mL	BD Falcon	352070	Disponibile da diversi fornitori.
HEPES; Acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico	Sigma-Aldrich	H3375	Disponibile da diversi fornitori.
MES; Acido 4-Morfolinetsolfonico monoidrato	Sigma-Aldrich	69892	Disponibile da diversi fornitori.
Rubinetti; Acido N-[Tris(idrossimetil)metil]-3-amminopropansolfonico	Sigma-Aldrich	T5130	Disponibile da più fornitori.
Obiettivo pneumatico 10X/0,45	Zeiss	000000-1063-139	Obiettivi comparabili possono essere sostituiti. Gli obiettivi 40X possono essere utilizzati per l'imaging di singole cellule.
Stereoscopio da dissezione	Zeiss	Discovery.V8	È possibile utilizzare qualsiasi stereoscopio da dissezione.
UAS-pHerry transgenico Drosophila melagnogaster	Disponibile da Romero Lab		Prima pubblicazione: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Disponibile da Romero Lab		Prima pubblicazione: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Disponibile da Romero Lab		Prima pubblicazione: Citation 2
Fotocamera digitale monocromatica ad alta sensibilità	Zeiss	Axiocam 506 mono	La marca e il modello esatti possono variare, possono essere sostituiti con qualsiasi fotocamera monocromatica ad alta sensibilità adatta all'imaging cellulare dal vivo.
Set di filtri GFP/FITC, 470/40 nm ex., 515 nm long-pass em., 500 nm dicroico	Chroma	CZ909	È possibile sostituire qualsiasi set di filtri GFP/FITC.
Set di filtri RFP/TRITC, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dicroica	Chroma	CZ915	È possibile sostituire qualsiasi set di filer GFP/FITC.
Microscopio epifluoescente invertito	Zeiss	Axio Observer Z.1	È possibile utilizzare qualsiasi microscopio comparabile con commutazione motorizzata del filtro. I microscopi verticali possono essere utilizzati con bagni di perfusione aperti e obiettivi a immersione in acqua.
Software di analisi statistica	Microcal	Origin 6.0	Qualsiasi software con funzionalità comparabili può essere sostituito Software
analisi delle immagini	Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Qualsiasi software con funzionalità comparabili può essere sostituito Software
acquisizione immagini	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Qualsiasi software con funzionalità comparabili può essere sostituito
Scienze della microscopia elettronica della lama del rasoio del acciaio al carbonio a taglio singolo		71960	Disponibile da più fornitori.
Cartella per vetrini per microscopia	Fisher Scientific	16-04	Disponibile da diversi fornitori.
Bruciatore Bunsen	Fisher Scientific	50-110-1231	Disponibile da diversi fornitori.
Polistrene Drosophila Fiale di allevamento con Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Articoli comparabili possono essere sostituiti.
Secchiello per il ghiaccio da laboratorio da 2,5 L	Fisher Scientific	07-210-129	Disponibile da diversi fornitori.
NMDG; N-metil-D-glucamina	Sigma-Aldrich	M2004	Disponibile da più fornitori.
Puntali per pipette a barriera da 200 uL	MidSci	AV200	Disponibile presso diversi fornitori.
200 μ Pipetta a volume variabile L	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Disponibile presso diversi fornitori.

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