Optisk kvantifisering av intracellulær pH i Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia med fluorescerende genetisk kodet pH indikator

Summary

Mobilnettet ion transport kan ofte vurderes ved å overvåke intracellulær pH (pH_jeg). Genetisk gir kodet pH-indikatorer (GEpHIs) optisk kvantifisering av intracellulær pH i intakt celler. Denne protokollen detaljer kvantifisering av intracellulær pH gjennom mobilnettet ex vivo live-avbildning av Malpighian tubules i Drosophila melanogaster med pHerry, en pseudo-ratiometric kodet genetisk pH-indikator.

Abstract

Epitel ion transport er avgjørende for systemisk ion homeostase samt vedlikehold av avgjørende mobilnettet elektrokjemiske graderinger. Intracellulær pH (pH_jeg) er påvirket av mange ion transportører og dermed overvåking pH_jeg er et nyttig verktøy for å vurdere transporter aktivitet. Moderne genetisk kodet pH-indikatorer (GEpHIs) gir optisk kvantifisering av pH_jeg i intakt celler i mobilnettet og subcellular skala. Denne protokollen beskriver sanntid kvantifisering av mobilnettet pH_jeg regulering i Malpighian Tubules (MTs) av Drosophila melanogaster gjennom ex vivo live-avbildning av pHerry, en pseudo-ratiometric GEpHI med en pK_en velegnet spore pH endringer i stoffer. Utdraget voksen fly MTs består av morphologically og funksjonelt forskjellige deler av encellede lag epithelia, og kan fungere som en tilgjengelig og genetisk medgjørlig modell for undersøkelse av epitelial transport. GEpHIs tilbyr flere fordeler sammenlignet med konvensjonelle pH-sensitive fluorescerende fargestoffer og ion-selektiv elektroder. GEpHIs kan merke ulike celle populasjoner forutsatt riktig promoter elementer finnes. Denne merking er spesielt nyttig i ex vivo, vivoog i situ preparater, som er iboende heterogene. GEpHIs også tillater kvantifisering av pH_i intakt vev over tid uten behovet for gjentatt fargestoff behandling eller vev eksternalisering. Den viktigste ulempen av gjeldende GEpHIs er tendensen å samle i cytosolic Inneslutninger svar vevsskade og konstruere over uttrykk. Disse svakhetene, sine løsninger og de iboende fordelene med GEpHIs er vist i denne protokollen gjennom vurdering av basolateral proton (H⁺) transport i funksjonelt forskjellige rektor og stellate celler av utdraget fly MTs. Teknikker og analyse beskrevet er lett tilpasses en rekke vertebrate og invertebrate forberedelser, og raffinementet til analysen kan skaleres fra undervisningen labs til intrikate fastsettelse av ion flux via bestemte transportører.

Introduction

Målet med denne protokollen er å beskrive kvantifisering av intracellulær pH (pH_i) bruker en genetisk kodet pH-indikator (GEpHI) og demonstrere hvordan denne metoden kan brukes til å vurdere basolateral H⁺ transport i en modell insekt (D. melanogaster) nyre struktur, Malpighian tubule (MT). MTs tjene som frukt fly excretory organer og ligner funksjonelt på pattedyr nyre i flere viktige henseender¹. MTs er arrangert som 2 par av tubules (fremre og bakre) i thorax og buk fly. Encellede epithelial tube hver MT består av metabolsk aktive viktigste celler med forskjellige apikale (luminal) og basolateral (hemocoel) polaritet samt under Sommer stellate celler. Fremre MTs består av 3 morphologically, funksjonelt, og developmentally forskjellige segmenter, spesielt første dilated segmentet, overgangsreglene segmentet og sekretoriske hovedavdeling avsnitt, som kobles til ureter². I cellular skala trans-epitelial ion transport i lumen oppnås ved en apikale plasma membran V-ATPase³ og en alkali-metall/H⁺ exchanger, samt en basolateral Na⁺-K⁺-ATPase⁴, innover-likeretter K⁺ kanaler⁵, Na⁺-drevet Cl⁻/HCO₃⁻ exchanger (NDAE1)⁶og Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69)⁷, mens stellate celler megle Cl^– og vann transport^8,9. Dette komplekse, men tilgjengelig fysiologiske systemet gir gode muligheter for undersøkelse av endogene ion transportmekanismer kombinert med de ulike genetiske og atferdsmessige verktøysett av Drosophila.

Begrunnelsen for denne protokollen var å beskrive et genetisk formbare system for å studere epithelial ion transport med potensial for integrasjon fra cellen til oppførsel og eksport av verktøy for andre modellsystemer. Uttrykk for pHerry¹⁰, en GEpHI avledet fra en blanding av grønn pH-sensitive super ekliptikken pHluorin^11,12 (SEpH) og røde pH-ufølsom mCherry¹³, i MTs tillater kvantifisering av H⁺ transport i MT enkeltceller gjennom de høye K⁺/nigericin kalibrering teknikk¹⁴. Som mange ion transportører flytte H⁺ -ekvivalenter, serverer kvantifisering av intracellulær pH_jeg som en funksjonell representasjon av ion bevegelse via en rekke transportører. Drosophila MT modell systemet tilbyr også kraftig genetisk verktøy i vev-spesifikke transgene¹⁵ og RNA forstyrrelser (RNAi)¹⁶ uttrykk som kan kombineres med mobil bildebehandling og hele-orgel analyser^{17 , 18 , 19} av tubule-funksjonen til å opprette et solid verktøysett med vertikal integrasjon fra molekyler virkemåten. Dette står i kontrast til mange andre protokoller for å vurdere epithelial biologi, som historisk slike målinger har stolt på intrikate og skremmende mikro-disseksjon, sofistikerte ion-selektiv elektroder^20,21, og dyre pH-sensitive fargestoffer²² med restriktiv lasting krav og dårlig mobilnettet spesifisitet heterogen vev. GEpHIs har blitt brukt mye måle pH_jeg i en rekke cellen typer²³. Tidlige arbeid utnyttet iboende pH-følsomheten av Green fluorescerende Protein (GFP) å overvåke pH_jeg kulturperler epitelceller²⁴ men de siste to tiårene har sett GEpHIs brukes i neurons²⁵, glia²⁶, sopp²⁷ , og plant celler²⁸. Kombinasjonen av potensialet for mobilnettet målretting av genetisk konstruksjoner gjennom GAL4/UAS uttrykk systemet¹⁵ og fysiologiske tilgjengelighet av Drosophila MT gjør dette til en ideell forberedelse til undersøkelser av pH_jeg regulering og epithelial ion transport.

pH_jeg regulering har vært studert i flere tiår og er avgjørende for liv. MT utarbeidelse tilbyr en robust modell å lære fysiologi av pH_jeg regulering, men også utføre avanserte undersøkelser av pH_i regulering ex vivo og i vivo. Denne protokollen beskriver kvantifisering av H⁺ bevegelse over basolateral membran av epitelceller av Drosophila MT bruker NH₄Cl puls syre lasting teknikk²¹, men som pH-indikatoren er genetisk kodet, kan disse metodene og teoretisk struktur brukes på noen forberedelser mottakelig for transgenesis og live-imaging.

Protocol

Alle trinn i denne protokollen overholde Mayo Clinic (Rochester, MN) dyr bruk retningslinjene. 1. fly dyrehold Raise fluer og sett krysser etter standard dyrehold29.Merk: Fluorescerende reporter uttrykket av GAL4/UAS systemet er proporsjonal med temperaturen og dermed oppdrett temperatur kan justeres for å endre uttrykket nivå. Mens høy uttrykk nivåer ofte føre til en bedre signal-til-støy-forhold er denne tilstanden også forbundet med økt cytosoli…

Representative Results

Sunt vev og korrekt identifisering av fremre MTs er avgjørende for suksessen til denne protokollen. Under disseksjon, bør man være forsiktig å ikke direkte berøring MTs og skal bare dem ved ureter så gripende MTs direkte fører til brudd (figur 4A- B). Når MTs er feid flatt inn i lysbildet, på tubuli må bli rørt mulig og overflødig bevegelse unngått som dette vil skade encellede epiteliale lag (<strong class="xfi…

Discussion

Suksessen til kvantifisering av pH_jeg i Drosophila MTs avhenger helt helse utdraget MTs og kvaliteten på montering og disseksjon (Figur A – C). Således, forsiktig håndtering av vev som beskrevet er viktig. Lysbilder fersk belagt i PLL vesentlig hjelpemiddel MT montering som de pleier å være mye mer lim enn lysbilder som tidligere har vært utsatt til løsning. Forsiktig montering vil også hjelpe i identifikasjon av forskjellige MT segmenter (<…

Materials

Poly-L-Lysine Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.