Hele-cel patch-klem opnames van geïsoleerde primaire epitheliale cellen uit de epididymis
Summary
Wij presenteren een protocol dat celisolatie en volledige cilinder patch-clamp opname combineert om de elektrische eigenschappen van de primaire gedissocieerde epitheelcellen van de rat cauda epididymiden te meten. Dit protocol maakt het mogelijk om de functionele eigenschappen van primaire epididymale epitheelcellen te onderzoeken om de fysiologische rol van de epididymis verder te verduidelijken.
Abstract
De epididymis is een essentieel orgaan voor de rijping van volwassenen en de voortplantingsgezondheid. Het epididymale epithelium bestaat uit ingewikkeld verbonden celtypen die niet alleen verschillen in moleculaire en morfologische eigenschappen maar ook in fysiologische eigenschappen. Deze verschillen weerspiegelen hun uiteenlopende functies, die samen de noodzakelijke micro-omgeving opbouwen voor de ontwikkeling van post-testiculaire sperma in het epididymale lumen. Het begrip van de biofysische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen is cruciaal voor het onthullen van hun functies in sperma en voortplantingsgezondheid, zowel onder fysiologische als pathofysiologische omstandigheden. Hoewel hun functionele eigenschappen nog niet volledig moeten worden opgemerkt, kunnen de epididymale epitheliale cellen worden bestudeerd met behulp van de patch-clamp techniek, een hulpmiddel voor het meten van de cellulaire gebeurtenissen en de membraan eigenschappen van enkele cellen. Hier beschrijven we de methoden van celisolatie en full-cell patch-clamp opname naar meaZeker de elektrische eigenschappen van primaire gedissocieerde epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden.
Introduction
De epididymis in het mannelijke voortplantingsstelsel is een orgaan gevoerd met een laag mosaïcepitheelcellen. Zoals bij andere epitheliale weefsels werken de verschillende celtypes van het epididymale epithelium, inclusief hoofdcellen, duidelijke cellen, basale cellen en cellen uit de immunologische en lymfatische systemen, op een gecoördineerde manier om de barrière aan de voorkant van de buis te functioneren en als Ondersteunende cellen voor sperma rijping en fysiologie 1 , 2 , 3 . Zo spelen deze epitheelcellen een essentiële rol in de reproductieve gezondheid.
Epitheliale cellen worden in het algemeen beschouwd als niet-excitabele cellen die niet in staat zijn om alle of geen actiepotenties te genereren in reactie op depolariserende stimuli, door gebrek aan spanningsgated Na + of Ca 2+ kanalen 4 , 5 . Echter, epitheelcellen drukken uni uitQue sets van ionkanalen en transporteurs die hun gespecialiseerde fysiologische rollen regelen, zoals secretie- en voedingsvervoer 6 . Verschillende epitheelcellen beschikken over karakteristieke elektrische eigenschappen. De hoofdcellen drukken bijvoorbeeld de CFTR uit voor vloeistof- en chloridevervoer en expressie de TRPV6 voor calciumreabsorptie, terwijl de duidelijke cellen de protonpomp V-ATPase uitdrukken voor luminale verzuring 1 , 7 , 8 , 9 . Sommige transporters en ionenkanalen die de fysiologische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen regelen, zijn gemeld, maar de functionele eigenschappen van epididymale epitheelcellen zijn grotendeels nog niet begrepen 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-cel patch-klem opname is een goed gevestigde techniek om de intrinsieke eigenschappen van beide excitabele en niet-excitabele cellen te onderzoeken en is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de functies van hoofdzakelijk gedissocieerde cellen in heterogene celmonsters; De spanningsclamp wordt gebruikt voor het meten van de passieve membraan eigenschappen en de ionische stromen van enkele cellen 14 , 15 . De passieve membraan eigenschappen omvatten input weerstand en capaciteit. De voormalige parameter geeft de intrinsieke membraanconductie aan, terwijl de laatste het oppervlak van het celmembraan impliceert (een fosfolipide bilayer, waar ionkanalen en transporteurs zich bevinden, die dienen als een dunne isolator die extracellulaire en intracellulaire media scheidt). De membraancapaciteit is direct evenredig aan het oppervlak van het celmembraan. Samen met de membraanweerstand die wordt weerspiegeld door de invoerweerstand, is de membraan tijdconstante, wWat aangeeft hoe snel het celmembraanpotentieel reageert op de stroom van ionenkanaalstromen, kan worden bepaald. In dit verband wordt door de combinatie van de huidige responseigenschappen van een reeks spanningstappen toegepast op de cellen, de biofysische kinetiek en eigenschappen van de cellen bepaald 15 , 16 , 17 , 18 .
In het onderhavige document beschrijven we de procedures voor het isoleren van epitheliale cellen uit de rat cauda epididymis en de stappen voor het meten van de membraan eigenschappen van verschillende celletypes in het gedissocieerde celmengsel met behulp van de gehele cel patch-klem. We tonen aan dat de epididymale hoofdcellen verschillende membraanelektrophysiologische eigenschappen vertonen en dat de geleiders gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd uit andere celsoorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol leverde de enzymatische dispersie van de rat-cauda-epididymiden consistente gezonde epitheelcellen. De kwaliteit van de epididymale epitheelcellen voor de patch-clamp experimenten is afhankelijk van een paar kritieke stappen in het protocol. Bijvoorbeeld, de centrifugatie van het celmengsel bij een lage centrifugale kracht (30 xg) is belangrijk voor het verwijderen van de spermatozoa en het epididymale luminale gehalte; De epididymale epitheelcellen worden ongezond in aanwezigheid van de spermatozoa in d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Christopher Antos voor nuttige opmerkingen over de tekst. Dit werk werd ondersteund door startschotfinanciering van de ShanghaiTech University toegekend aan Winnie Shum en door de financiering van de National Natural Science Foundation of China (NNSFC nr. 31471370).
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
