Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l'épididyme
Summary
Nous présentons un protocole qui combine l'isolation cellulaire et l'enregistrement de patch-clamp à cellules entières pour mesurer les propriétés électriques des cellules épithéliales dissociées primaires des épididymides de cauda de rat. Ce protocole permet d'étudier les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales épididymiques primaires afin d'élucider davantage le rôle physiologique de l'épididyme.
Abstract
L'épididyme est un organe essentiel pour la maturation du sperme et la santé reproductive. L'épithélium épididymal se compose de types cellulaires complexes qui sont distincts non seulement dans les caractéristiques moléculaires et morphologiques, mais aussi dans les propriétés physiologiques. Ces différences reflètent leurs diverses fonctions qui, ensemble, établissent le microenvironnement nécessaire pour le développement du sperme post-testiculaire dans la lumière épididymique. La compréhension des propriétés biophysiques des cellules épithéliales épididymatiques est essentielle pour révéler leurs fonctions dans le sperme et la santé reproductive, dans des conditions physiologiques et pathophysiologiques. Bien que leurs propriétés fonctionnelles n'aient pas encore été pleinement élucidées, les cellules épithéliales épididymatiques peuvent être étudiées à l'aide de la technique de patch-clamp, un outil pour mesurer les événements cellulaires et les propriétés membranaires des cellules individuelles. Ici, nous décrivons les méthodes d'isolement cellulaire et d'enregistrement de patch-clamp à cellules entières pour meaAssurez-vous que les propriétés électriques des cellules épithéliales dissociées primaires des épididymides de la queue de rat.
Introduction
L'épididyme dans le tractus reproducteur masculin est un organe doublé d'une couche de cellules épithéliales en mosaïque. Comme dans d'autres tissus épithéliaux, les différents types cellulaires de l'épithélium épididymal, y compris les cellules principales, les cellules claires, les cellules basales et les cellules des systèmes immunologiques et lymphatiques, fonctionnent de manière concertée pour fonctionner comme barrière à la ligne de front du tubule et en tant que Cellules de soutien pour la maturation du sperme et la physiologie 1 , 2 , 3 . Ainsi, ces cellules épithéliales jouent un rôle essentiel dans la santé reproductive.
Les cellules épithéliales sont généralement considérées comme des cellules non excitables qui ne permettent pas de générer des potentiels d'action tout ou rien en réponse à des stimuli dépolarisants, en raison du manque de canaux Na + ou Ca 2+ 4 , 5 de tension. Cependant, les cellules épithéliales expriment uniQuels ensembles de canaux ioniques et de transporteurs qui régulent leurs rôles physiologiques spécialisés, tels que la sécrétion et le transport d'éléments nutritifs 6 . Par conséquent, différentes cellules épithéliales possèdent des propriétés électriques caractéristiques. Par exemple, les cellules principales expriment le CFTR pour le transport des fluides et des chlorures et expriment le TRPV6 pour la réabsorption du calcium, tandis que les cellules claires expriment la pompe à protons V-ATPase pour l'acidification luminal 1 , 7 , 8 , 9 . Certains transporteurs et canaux ioniques qui régulent les caractéristiques physiologiques des cellules épithéliales épididymatiques ont été rapportés, mais les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales épididymatiques ne sont pas encore comprises 10 , 11 , 12 , 13 .
WhL'enregistrement de la pince à l'aide d'une cellule oléicole est une technique bien établie pour examiner les propriétés intrinsèques des cellules excitables et non excitables et est particulièrement utile pour étudier les fonctions des cellules principalement dissociées dans des échantillons cellulaires hétérogènes; La tension de serrage est utilisée pour mesurer les propriétés de la membrane passive et les courants ioniques des cellules individuelles 14 , 15 . Les propriétés de la membrane passive comprennent la résistance d'entrée et la capacité. Le premier paramètre indique la conductance de la membrane intrinsèque, tandis que ce dernier implique la surface de la membrane cellulaire (une bicouche de phospholipides, où se trouvent les canaux ioniques et les transporteurs, qui sert d'isolant mince séparant les milieux extracellulaires et intracellulaires). La capacité de la membrane est directement proportionnelle à la surface de la membrane cellulaire. Avec la résistance de la membrane qui est réfléchie par la résistance d'entrée, la constante de temps de la membrane, wCe qui indique la rapidité avec laquelle le potentiel de la membrane cellulaire répond au flux des courants des canaux ioniques, peut être déterminé. À cet égard, en combinant les caractéristiques de réponse actuelles d'une série d'étapes de tension appliquées aux cellules, la cinétique biophysique et les propriétés des cellules sont déterminées 15 , 16 , 17 , 18 .
Dans le présent document, nous décrivons les procédures d'isolement des cellules épithéliales à partir de l'épididyme de la queue du rat et les étapes pour mesurer les propriétés de la membrane de différents types de cellules dans le mélange de cellules dissociées en utilisant la pince à cellules entières. Nous montrons que les cellules principales épididymiques présentent des propriétés électrophysiologiques membranaires distinctes et que les conductances peuvent être facilement identifiées à partir d'autres types de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, la dispersion enzymatique des épididymides de cauda de rat a consisté à produire des cellules épithéliales saines. La qualité des cellules épithéliales épididymatiques pour les expériences de patch-clamp dépend de quelques étapes critiques du protocole. Par exemple, la centrifugation du mélange cellulaire à une faible force centrifuge (30 xg) est importante pour éliminer les spermatozoïdes et la teneur en luminescence épididymique; Les cellules épithéliales épididymiques deviennent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Christopher Antos pour des commentaires utiles sur le texte. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de ShanghaiTech University attribués à Winnie Shum et par le financement de la National Natural Science Foundation of China (NNSFC n ° 31471370).
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
Riferimenti
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
