Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay
Summary
Her er det demonstreret, hvordan in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan anvendes til at detektere og visualisere de direkte protein-proteininteraktioner mellem ATM og p53 i suspensionscellekulturer udsat for genotoksisk stress.
Abstract
DNA-skaderesponset orkestrerer reparationen af DNA-læsioner, som forekommer spontant, forårsages af genotoksisk stress eller forekommer i sammenhæng med programmerede DNA-pauser i lymfocytter. Ataxia-Telangiectasia-muteret kinase (ATM), ATM- og Rad3-beslægtet kinase (ATR) og den katalytiske underenhed af DNA-afhængig proteinkinase (DNA-PKcs) er blandt de første, der aktiveres ved induktion af DNA-beskadigelse og er Centrale regulatorer af et netværk, der styrer DNA-reparation, apoptose og celleoverlevelse. Som en del af en tumorundertrykkende vej aktiverer ATM og ATR p53 gennem phosphorylering og derved regulerer den transkriptionelle aktivitet af p53. DNA-beskadigelse resulterer også i dannelsen af såkaldt ioniserende strålingsinduceret foci (IRIF), som repræsenterer komplekser af DNA-beskadigelsesføler og reparationsproteiner, der akkumulerer ved DNA-beskadigelsesstederne, som visualiseres ved fluorescensmikroskopi. Samlokalisering af proteiner i IRIF'er indebærer imidlertid ikke nødvendigvis dIrect protein-proteininteraktioner, da opløsningen af fluorescensmikroskopi er begrænset.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) er en ny teknik, der muliggør direkte visualisering af protein-protein interaktioner i celler og væv med hidtil uset specificitet og følsomhed. Denne teknik er baseret på den rumlige nærhed af specifikke antistoffer, som binder til proteiner af interesse. Når de forhørte proteiner er inden for ~ 40 nm, udløses en amplifikationsreaktion af oligonukleotider, som er konjugeret til antistofferne, og amplifikationsproduktet visualiseres ved fluorescensmærkning, hvilket giver et signal, som svarer til den intercellulære placering af de interagerende proteiner. Ved hjælp af den etablerede funktionelle vekselvirkning mellem ATM og p53 som et eksempel, er det her vist, hvordan PLA kan anvendes i suspensionscellekulturer til at studere de direkte interaktioner mellem proteiner, som er integrerende dele af DNA-skaderesponsen.
Introduction
DNA-skader udløser en stærkt reguleret serie af hændelser, der involverer protein-protein-interaktioner og post-translationelle modifikationer, der sikrer effektiv og hurtig reparation af DNA, hvorved der sikres genomisk integritet 1 . Typisk bliver DNA-reparation undersøgt i celler udsat for ioniserende stråling ved at overvåge dannelsen af såkaldt ioniserende strålingsinduceret foci (IRIF) ved (konfokal) fluorescensmikroskopi. Mange DNA-reparations- og DNA-skadesfølerproteiner danner IRIF'er, som repræsenterer proteinkomplekser, der nucleerer ved chromatinsteder, der opretholder DNA-beskadigelse 2 , 3 . Placeringen og opløsningen af IRIF'er over tid giver et vigtigt indblik i spatiotemporal organisering af DNA-reparation og kan indikere involvering af forskellige DNA-reparationsveje. Arten af DNA-beskadigelsen og cellecyklusfasen, hvor skaden er opnået, bestemmer hvilken DNA-reparationsvej der aktiveres. fo For eksempel er homolog rekombination (HR) i celler, der er aktivt involveret i DNA-replikation (S-fase), den dominerende DNA-reparationsvej, hvorimod i celler i G1- eller G2 / M-fasen af cellecyklussen, Homolog end-joining (NHEJ) reparationsvej dominerer. En af de tidligste hændelser, der følger med DNA-beskadigelse, er aktiveringen af DNA-beskadigende kinaser Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), som hovedsagelig er aktiv i Cellecyklets G1- og G2 / M-faser og regulerer NHEJ, Og Ataxia Telangiectasia og Rad3-relateret protein (ATR), som virker i S-fase ved at aktivere HR. Både ATM og ATR er meget pleiotropiske kinaser, der phosphorylerer mange proteiner, der er involveret i DNA-reparation, celledød og overlevelse 4 . Begge kinaser har vist sig at phosphorylere og aktivere tumor-suppressorproteinet p53 efter eksponeringen for genotoksisk stress, hvilket indikerer, at disse kinaser er opstrøms mediatorer af en svingende tumorundertrykkende signalakse"Xref"> 5 , 6 .
Dannelsen og sammensætningen af IRIF'er vurderes typisk ved at bestemme co-lokalisering af forskellige proteiner ved anvendelse af dobbeltfarve immunofluorescensfarvning og mikroskopi, men ikke alle proteiner, som er en del af reparationsproteinkomplekser, danner IRIF'er, hvilket begrænser anvendeligheden af denne fremgangsmåde. Desuden er (konfokal) immunofluorescensmikroskopi begrænset af diffraktionsegenskaberne af lys, hvilket resulterer i en ret dårlig rumlig opløsning på ca. 200-300 nm, der overstiger størstedelen af de fleste subcellulære strukturer, hvilket i det væsentlige forbyder direkte undersøgelse af protein-proteininteraktioner ved Det molekylære niveau. Som sådan er co-lokalisering af immunofluorescensfarvningsmønstre som detekteret af (konfokal) fluorescensmikroskopi ikke nødvendigvis indicative for direkte protein-protein-interaktioner. For nylig er der udviklet nye superopløsnings teknologier, såsom tredimensionelle strukturerTured illuminationsmikroskopi (3D-SIM) 7 , som med succes blev brugt til at studere 53BP1 og BRCA1 IRIF-dannelse ved nano-skala-detaljer, hvilket afslørede de rumlige fordelingsegenskaber for disse proteiner, som ikke kunne detekteres ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi 8 .
Adskillige andre metoder kan anvendes til at detektere protein-protein-interaktioner in vivo , såsom co-immunopræcipitation, pull-down-metoder og gær-to-hybrid screeningsmetoder. Imidlertid er disse teknikker ret besværlige, kræver store mængder af celler eller proteiner eller involverer overekspression af proteiner, som introducerer eksperimentelle artefakter. For nylig er der udviklet en ny teknik, der muliggør visualisering og kvantificering af protein-protein-interaktioner in situ ( dvs. i celler og i væv), som kaldes Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . prImary-antistoffer, som genkender to proteiner af interesse, detekteres af sekundære antistoffer, som er konjugeret til oligonukleotider (såkaldte PLA-prober). Hvis de to forskellige sekundære antistoffer er tilstrækkeligt tætte på grund af interaktioner mellem proteinerne genkendt af de primære antistoffer, hybridiserer de konjugerede oligonukleotider og kan ligeres til dannelse af et lukket cirkulært DNA-substrat. Dette cirkulære substrat amplificeres efterfølgende ved hjælp af rullende cirkelamplifikation og visualiseres med fluorochrom-konjugerede komplementære oligonukleotider. Ved anvendelse af PLA bevares den subcellulære lokalisering af protein-proteininteraktionen, idet det fluorescensmærkede rullecirkelforstærkelsesprodukt forbliver fastgjort til PLA-proberne. Opløsningen af dette assay er <50 nm, baseret på den konstatering, at diameteren af et antistof er ca. 7-10 nm 11 . Rulcirkelforstærkning kan kun finde sted, hvis to par antistoffer (primær + seconDary) fysisk interagere inden for perimeteren, der er defineret af deres størrelse (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Signalforstærkningstrinnet øger følsomheden af PLA-analysen og muliggør detektion af interaktioner af knap udtrykte proteiner. PLA genererer punkterede, foci-lignende signaler, der kan kvantificeres pr. Cellebasis, hvormed den intra- og intercellulære variation i protein-protein-interaktioner kan vurderes.
Dannelsen og sammensætningen af DNA-reparationskomplekser og IRIF'er studeres for det meste i adhærente cellelinjer, såsom den humane knogle osteosarkomepithelcellelinie U2OS, den humane embryonale nyrelinje HEK293 og den retinale pigmentepitelcellelinie RPE-1, som er hurtig- Voksende og let at transfektere. Suspension celle kulturer sådanne lymfoide og myeloid cellelinier anvendes mindre hyppigt, da disse er mindre modtagelige for transfektion og generelt ikke klæber til coverlips, hvilket således kræver yderligere / alternativ stEps til billedbehandling. Opløsningen af DNA-beskadigelse er imidlertid meget relevant i forbindelse med lymfoide og myelide maligniteter, da DNA-skaderesponset ofte påvirkes af genomiske (driver) aberrationer i disse tumorer og spiller en afgørende rolle i den ondartede transformation af normal lymfoid og myeloid ( Stamceller) celler 12 , 13 , 14 .
Denne protokol beskriver, hvordan PLA kan anvendes til at vurdere og kvantificere protein-proteininteraktioner efter induktionen af DNA-beskadigelse i suspensionscellekulturer. Her udføres PLA for at bestemme og visualisere interaktionerne mellem ATM og p53 ved DNA-beskadigelse i humane B-celle-leukæmiceller, som induceres at gennemgå en G1-fase cellecyklusarrest. Bemærk, at protokollen, der præsenteres her, ikke er begrænset til at studere ATM- og p53-interaktioner i G1-arresterede leukæmiceller, men kan også anvendes til at visualisere andre protein-proteininterI forskellige celletyper og suspensionscellekulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapport er det påvist, at PLA kan anvendes til at bestemme og visualisere den specifikke interaktion mellem proteiner i suspensionscellekulturer. Bemærk, at den her beskrevne protokol ikke er begrænset til undersøgelsen af DNA-reparationskomplekser, men også gælder for visualisering og kvantificering af andre protein-protein-interaktioner i suspensionscellekulturer. Det er vist at ATM-kinasen interagerer med phosphoryleret p53 i G1-arresterede BCR-ABL + B-ALL-celler, når de udsættes for et DNA-skad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Guikema laboratoriet finansieres af Innovationsforskningsincentiverne fra Den Hollandske Organisation for Videnskabelig Forskning (VIDI-bevilling 016126355) og Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (projekt 252).
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
Riferimenti
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin’s lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
