Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay
Summary
Här demonstreras hur in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan användas för att detektera och visualisera direkt protein-protein-interaktioner mellan ATM och p53 i suspensionscellkulturer utsatta för genotoxisk stress.
Abstract
DNA-skadans svar orkestrerar reparationen av DNA-lesioner som uppträder spontant, orsakas av genotoxisk stress eller framträder i samband med programmerade DNA-raster i lymfocyter. Ataxia-Telangiectasia-muterad kinas (ATM), ATM- och Rad3-besläktad kinas (ATR) och den katalytiska subenheten av DNA-beroende proteinkinase (DNA-PKcs) är bland de första som aktiveras vid induktion av DNA-skada och är Centrala regulatorer av ett nätverk som kontrollerar DNA-reparation, apoptos och cellöverlevnad. Som en del av en tumörundertryckande väg aktiverar ATM och ATR p53 genom fosforylering, varigenom p53-transkriptionsaktiviteten regleras. DNA-skada resulterar också i bildandet av så kallad joniserande strålningsinducerad foci (IRIF) som representerar komplex av DNA-skada sensor och reparationsproteiner som ackumuleras vid ställena för DNA-skada, vilka visualiseras genom fluorescensmikroskopi. Samlokalisering av proteiner i IRIF innebär emellertid inte nödvändigtvis dIrect protein-protein interaktioner, eftersom upplösningen av fluorescensmikroskopi är begränsad.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) är en ny teknik som möjliggör direkt visualisering av protein-protein interaktioner i celler och vävnader med oöverträffad specificitet och känslighet. Denna teknik är baserad på den rumsliga närheten av specifika antikroppar som binder till proteiner av intresse. När de utfrågade proteinerna ligger inom ~ 40 nm utlöses en amplifieringsreaktion av oligonukleotider som är konjugerade till antikropparna och amplifieringsprodukten visualiseras genom fluorescerande märkning, vilket ger en signal som motsvarar den intercellulära placeringen av de interaktiva proteinerna. Genom att använda den etablerade funktionella interaktionen mellan ATM och p53 som exempel visas det hur PLA kan användas i suspensionscellkulturer för att studera de direkta interaktionerna mellan proteiner som är integrerade delar av DNA-skadans respons.
Introduction
DNA-skada utlöser en starkt reglerad serie av händelser som involverar protein-protein-interaktioner och post-translationella modifieringar som säkerställer effektiv och snabb reparation av DNA, varigenom genomisk integritet skyddas 1 . Typiskt studeras DNA-reparation i celler som exponeras för joniserande strålning genom att övervaka bildningen av så kallad joniserande strålningsinducerad foci (IRIF) genom (konfokal) fluorescensmikroskopi. Många DNA-reparation och DNA-skada-sensingproteiner bildar IRIF, vilka representerar proteinkomplex som kärnar vid kromatinställen som upprätthåller DNA-skada 2 , 3 . Placeringen och upplösningen av IRIFs över tid ger en viktig inblick i spatiotemporal organisation av DNA-reparation och kan indikera involvering av olika DNA-reparationsvägar. Naturen hos DNA-skadorna och cellcykelsteget där skadan uppnås bestämmer vilken DNA-reparationsväg som aktiveras. Fo I celler som är aktivt involverade i DNA-replikation (S-fas) är homolog rekombination (HR) den dominerande DNA-reparationsvägen, medan i celler i G1- eller G2 / M-fasen av cellcykeln är den icke- Homologa slutförbindningsvägar (NHEJ) dominerar. En av de tidigaste händelserna som följer DNA-skada är aktiveringen av DNA-skada-sensing-kinaserna Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), som är mest aktiv i cellcykeln G1 och G2 / M och reglerar NHEJ, Och Ataxia Telangiectasia och Rad3-relaterat protein (ATR), som verkar i S-fas genom att aktivera HR. Både ATM och ATR är mycket pleiotropa kinaser som fosforylerar många proteiner som är inblandade i DNA-reparation, celldöd och överlevnad 4 . Båda kinaserna har visat sig fosforylera och aktivera tumör-suppressorproteinet p53 efter exponeringen för genotoxisk stress, vilket indikerar att dessa kinaser är uppströms mediatorer av en svängbar tumördämpande signalaxel"Xref"> 5 , 6 .
Bildandet och sammansättningen av IRIFs bedöms typiskt genom att bestämma samlokalisering av olika proteiner med användning av dubbelfärgad immunfluorescensfärgning och mikroskopi, men inte alla proteiner som ingår i reparationsproteinkomplex bildar IRIF, vilket begränsar tillämpningen av denna metod. Vidare begränsas (konfokal) immunofluorescensmikroskopi av diffraktionsegenskaperna hos ljus, vilket resulterar i en ganska dålig rumsupplösning av ca 200-300 nm, som överskrider storleken på de flesta subcellulära strukturerna, vilket väsentligen förbjuder direktinterrogation av protein-protein-interaktioner vid Molekylär nivå. Som sådan är co-lokalisering av immunofluorescensfärgningsmönster som detekteras av (konfokal) fluorescensmikroskopi inte nödvändigtvis indicativ för direkta protein-protein-interaktioner. Nyligen har nya superresolutionstekniker utvecklats, såsom tredimensionell strucTured illuminationsmikroskopi (3D-SIM) 7 , som framgångsrikt användes för att studera 53BP1- och BRCA1-IRIF-bildning vid nanoskala detaljer, vilket avslöja de spatiala fördelningsegenskaperna hos dessa proteiner som inte kunde detekteras med konfokal laserskanningsmikroskopi 8 .
Flera andra metoder kan användas för att detektera protein-protein-interaktioner in vivo , såsom samimmunutfällning, neddragnings-metoder och jäst-två-hybrid-screeningsmetoder. Emellertid är dessa tekniker ganska besvärliga, kräver stora mängder celler eller proteiner eller involverar överuttryck av proteiner, som introducerar experimentella artefakter. Nyligen har en ny teknik utvecklats som möjliggör visualisering och kvantifiering av protein-protein-interaktioner in situ ( dvs i celler och i vävnader), som benämns Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . PrImariantikroppar som känner igen två proteiner av intresse detekteras av sekundära antikroppar som är konjugerade till oligonukleotider (så kallade PLA-prober). Om de två olika sekundära antikropparna är tillräckligt nära på grund av interaktioner mellan de proteiner som känns igen av de primära antikropparna hybridiserar de konjugerade oligonukleotiderna och kan ligeras för att bilda ett slutet cirkulärt DNA-substrat. Detta cirkulära substrat förstärks därefter genom valscirkelförstärkning och visualiseras med fluorokrom-konjugerade komplementära oligonukleotider. Med användning av PLA bevaras den subcellulära lokaliseringen av protein-protein-interaktionen, eftersom den fluorescensmärkta rullecirkelförstärkningsprodukten förblir bunden till PLA-proberna. Upplösningen av denna analys är <50 nm, baserat på det konstaterande att diametern av en antikropp är ungefär 7-10 nm 11 . Rullande cirkelförstärkning kan endast ske om två antikroppar (primära + sekonDary) interagerar fysiskt inom perimetern som definieras av deras storlek (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). Signalförstärkningsteget ökar känsligheten av PLA-analysen och möjliggör detektering av interaktioner av knappt uttryckta proteiner. PLA genererar punktade, foci-liknande signaler som kan kvantifieras per percellsbasis, genom vilken den intra- och intercelliga variationen i protein-protein-interaktioner kan bedömas.
Bildandet och sammansättningen av DNA-reparationskomplex och IRIF-sekvenser studeras mestadels i vidhäftande cellinjer, såsom den mänskliga ben-osteosarkomepitelcellinjen U2OS, den humana embryonala njurcellinjen HEK293 och retinalpigmentepitelcellinjen RPE-1, som är snabb- Växer och lätt att transfektera. Suspension cellkulturer sådana lymfoida och myeloidcellinjer används mindre ofta, eftersom dessa är mindre mottagliga för transfektion och i allmänhet inte vidhäftar täckglas, vilket därmed kräver ytterligare / alternativ stEps för bildbehandling. Upplösningen av DNA-skada är emellertid väldigt relevant i samband med lymfoida och myeloid maligniteter, eftersom DNA-skadornas reaktion ofta påverkas av genomiska (förare) aberrationer i dessa tumörer, spelar en nyckelroll i den maligna transformationen av normal lymfoid och myeloid ( Stamceller) 12 , 13 , 14 .
Detta protokoll beskriver hur PLA kan användas för att bedöma och kvantifiera protein-protein-interaktioner efter induktion av DNA-skada i suspensionscellkulturer. Här utförs PLA för att bestämma och visualisera interaktionerna mellan ATM och p53 vid DNA-skada i humana B-cellleukemiceller som induceras att genomgå en G1-fascellcykelhållande. Observera är protokollet som presenteras här inte begränsat till att studera ATM- och p53-interaktioner i G1-arresterade leukemi-celler, men kan också användas för att visualisera andra protein-proteininterI olika celltyper och suspensionscellkulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna rapport demonstreras att PLA kan användas för att bestämma och visualisera den specifika interaktionen mellan proteiner i suspensionscellkulturer. Observera är protokollet som beskrivs här inte begränsat till studien av DNA-reparationskomplex, men gäller även för att visualisera och kvantifiera andra protein-protein-interaktioner i suspensionscellkulturer. Det visas att ATM-kinaset interagerar med fosforylerad p53 i G1-arresterade BCR-ABL + B-ALL-celler när de utsätts för ett DNA-skada-inducerande me…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Guikema-laboratoriet finansieras av Innovationsforskningsincitamentprogrammet från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (VIDI-bidrag 016126355) och Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (projekt 252).
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
Riferimenti
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin’s lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
