Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como Ferramenta de Triagem In Vitro na Pesquisa Auditiva
Summary
O objetivo deste protocolo é demonstrar a preparação, cultura, tratamento e imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A técnica pode ser utilizada como ferramenta de seleção in vitro na pesquisa auditiva.
Abstract
Embora tenha havido avanços notáveis na pesquisa auditiva nas últimas décadas, ainda não há cura para a Perda auditiva sensorial (SNHL), uma condição que tipicamente envolve danos ou perda das delicadas estruturas mechanosensoriais da orelha interna. Ensaios sofisticados in vitro e ex vivo surgiram nos últimos anos, permitindo a triagem de um número crescente de compostos potencialmente terapêuticos, minimizando os recursos e acelerando os esforços para desenvolver curas para SNHL. Embora as culturas homogêneas de certos tipos de células continuem a desempenhar um papel importante na pesquisa atual, muitos cientistas agora contam com culturas organotípicas mais complexas de orelhas internas murinas, também conhecidas como explantes cocleares. A preservação de estruturas celulares organizadas dentro da orelha interna facilita a avaliação in situ de vários componentes da infra-estrutura coclear, incluindo células ciliadas internas e externas, neurônios ganglionares espirais, neurItes, e células de apoio. Aqui apresentamos a preparação, a cultura, o tratamento e a imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A preparação cuidadosa desses explantes facilita a identificação de mecanismos que contribuem para o SNHL e constitui uma ferramenta valiosa para a comunidade de pesquisa auditiva.
Introduction
Perda auditiva sensorial (SNHL) reflete dano ao ouvido interno ou via auditiva ascendente. Embora a perda de audição seja o déficit sensorial mais comum em humanos 1 , as terapias curativas ainda não existem 2 . Embora os implantes de tronco encefálicos cocleares ou auditivos possam restaurar algum grau de audição para pacientes com SNHL grave a profunda, a audiência fornecida por esses dispositivos ainda é muito diferente da audiência "natural", especialmente durante as tentativas de entender a fala em ruído ou para ouvir música.
Embora a degeneração de células ciliadas tenha sido considerada a principal conseqüência de eventos auditivos traumáticos ( por exemplo, exposição ao ruído alto), há evidências crescentes de que as sinapses que transportam informações de células ciliadas para o nervo auditivo são pelo menos tão vulneráveis a trauma acústico 3 , 4 , 5 </sup > , 6 . Uma vez que os limiares audiométricos humanos, o padrão ouro atual para a avaliação da função auditiva, não prevêem danos celulares específicos na orelha interna, são necessárias ferramentas mais refinadas para detectar a degeneração celular o mais rápido possível e para iniciar um tratamento adequado 7 .
Os tratamentos farmacêuticos promissores para a perda auditiva são freqüentemente testados em culturas celulares homogêneas in vitro , mas esses sistemas não modelam com precisão o microambiente coclear. Sabe-se que as células cocleares secretam fatores tróficos que influenciam outros tipos de células dentro da cóclea 8 , 9 , um processo in vivo crucial que se perde quando o órgão de Corti 10 , 11 ou Neurônios de Ganglion Espiral (SGNs) 12 são cultivados isoladamente ou quando Marcadores moleculares são analisados13. No entanto, estudos in vivo que podem ser necessários para a validação de dados in vitro para estabelecer novos tratamentos personalizados para a perda de audição na busca de "medicina de precisão" requerem recursos e tempo significativos. Isto é especialmente relevante quando se considera Quanto esforço é necessário para aperfeiçoar e realizar injeções de membrana de orelha média ou arredondada com testes auditivos e a subsequente dissecção de montagens inteiras cocleares. O rastreio eficiente de compostos promissores em culturas orgotípicas ex vivo conhecidas como explantes cocleares fornece uma alternativa econômica e confiável 14 , 15 , 16 , 17 .
Este artigo detalha um protocolo para gerar, manter e avaliar explantes cocleares tratados. As aplicações específicas para este modelo são enfatizadas, incluindo seu uso na seleçãoDe compostos potencialmente terapêuticos e a avaliação comparativa de vetores virais para terapia genética. Uma abordagem de explante ex vivo permite aos pesquisadores visualizar os efeitos de um determinado tratamento em diferentes populações celulares in situ , facilitando a identificação de mecanismos específicos do tipo celular e o aprimoramento subseqüente de terapias específicas.
No geral, esta técnica fornece um modelo para estudar a cóclea ex vivo, ao mesmo tempo em que preserva a conversação vital entre os tipos de células muito diferentes que coexistem dentro da cóclea.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os pesquisadores devem aperfeiçoar a técnica de dissecação antes de realizar experiências envolvendo explantes cocleares. As células do cabelo são comumente danificadas durante as dissecações realizadas no início da curva de aprendizado e um momento particularmente problemático para sua integridade é a remoção da membrana tectorial, que requer mãos firmes, ferramentas adequadas e experiência. Para economizar tempo e recursos, um controle visual deve ser realizado sob o microscópio de dissecação e áre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do Instituto Nacional de Surdez e Distúrbios da Comunicação R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (suporte de SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-15-1-0472 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS), o Nancy Sayles Day Foundation (KMS) e o Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Agradecemos a Jessica E. Sagers, BA por comentários perspicazes sobre o manuscrito.
Materials
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100×20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35×10 mm, four inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60×15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50×7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13-0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol, Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Glutamate – GlutaMAX supplement, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500ml | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 l | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4'' x 6'' – 2 mil. thick | Zipline | 0609132541599 |
Riferimenti
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