Inductie van hypoxie in levende kikker en zebravis embryo's
Summary
Wij introduceren een nieuw hypoxische kamer systeem voor gebruik bij aquatische organismen zoals kikker- en zebravis embryo's. Ons systeem is eenvoudig, robuust, kosteneffectief en zorgt voor inductie en onderhoud van hypoxie in vivo en gedurende 48 uur. We presenteren 2 reproduceerbare methoden om de effectiviteit van hypoxie te monitoren.
Abstract
Hier introduceren we een nieuw systeem voor hypoxie-inductie, die we ontwikkelden om de effecten van hypoxie in aquatische organismen zoals kikker- en zebravisembryo's te bestuderen. Ons systeem bestaat uit een kamer met een eenvoudige installatie die toch robuust is om een specifieke zuurstofconcentratie en temperatuur in elke gewenste experimentele oplossing te induceren en in stand te houden. Het gepresenteerde systeem is zeer kosteneffectief maar zeer functioneel, het maakt inductie en onderhoud van hypoxie mogelijk voor directe experimenten in vivo en voor verschillende perioden tot 48 uur.
Om de effecten van hypoxie te monitoren en te bestuderen hebben we twee methoden ingezet: meten van de mate van hypoxie-induceerbare factor 1alfa (HIF-1a) in hele embryo's of specifieke weefsels en bepaling van retinale stamcellen proliferatie door 5-ethynyl-2'- Deoxyuridine (EdU) incorporation in het DNA. HIF-1α niveaus kunnen dienen als een algemene hypoxie marker in het hele embryo of weefselVan keuze, hier embryonale netvlies. EdU-integratie in de prolifererende cellen van embryonale retina is een specifieke uitkomst van hypoxie-inductie. Zo hebben we aangetoond dat hypoxische embryonale retinale progenitors proliferatie verminderen binnen 1 uur incubatie onder 5% zuurstof van zowel kikker- als zebravis embryo's.
Eenmaal beheerd, kan onze installatie worden gebruikt voor kleine aquatische modelorganismen, voor directe in vivo experimenten, gedurende een bepaalde periode en onder normale, hypoxische of hyperoxische zuurstofconcentraties of onder een ander gegeven gasmengsel.
Introduction
Hypoxia onderzoek heeft tal van toepassingen. Deze omvatten onder meer het onderzoek naar de pathogenese en het ontwikkelen van behandelingen voor medische aandoeningen die gekenmerkt worden door hypoxie 1 en acute ziekte op hoog niveau 2 . Hypoxische stress veroorzaakt belangrijke metabolische veranderingen in alle organismen die zuurstof vereisen. Hypoxische stress beïnvloedt ook foetale groei en ontwikkeling en de pathogenese van diverse menselijke ziekten, met inbegrip van intraderine groeibeperking 3 . Hypoxische stress kan niet alleen leiden tot verminderde geboortegewicht, foetale en neonatale sterfte, maar kan ook leiden tot veel complicaties in het volwassen leven, zoals hart- en vaatziekten, type 2 diabetes, obesitas en hypertensie 4 . Hypoxische stress wordt ook vaak waargenomen bij het ontwikkelen van vaste tumoren, wanneer het tumorweefsel zijn bloedtoevoer uitstoot. Het is daarom van cruciaal belang om de effecten van hypoxie in vivo en direct tijdens embr te kunnen bestuderen Yonische ontwikkeling.
Onder de meest bekende methoden die zijn toegepast om de effecten van hypoxie tijdens de ontwikkeling te bestuderen, is het gebruik van kobaltchloride in het groeimedium of incubatie van het organisme in een hypoxische kamer. Cobaltchloride induceert kunstmatig een hypoxische reactie onder normale zuurstofconcentratie, door zijn rol bij de stabilisatie van hypoxie-inducerende factor-1 alfa (HIF-1a) door het voorkomen van de proteosomale afbraak van 5 , 6 , 7 . Echter, als een handige methode 8 kan het gebruik van kobaltchloride en andere soortgelijke chemische hypoxie-mimetica onspecifiek schadelijk effect hebben op cellen en weefsels, bijvoorbeeld apoptose 9 . Daarom zijn hypoxische kamers een betere methode voor het induceren van "natuurlijke hypoxie" in levende organismen door middel van normale ontwikkeling.
Ntent "> We hebben zich beziggehouden met het ontwikkelen van een systeem voor de inductie van hypoxie bij aquatische dierlijke embryo's. Zowel kikkers als zebravis zijn nu informatieve gewervelde modelorganismen geworden voor studies van talrijke biologische processen, evenals modellen voor diverse menselijke ziekten. Kikker- en zebravisembryo's Ontwikkelen extern, elimineren de complicatie van de materiële compensatie. Verder maakt een snelle ontwikkeling mogelijk om milieufactoren te manipuleren en de fenotypische veranderingen in orgelvorming in real-time te waarnemen. Bovendien worden veel componenten van belangrijke signaaltransductieroutes sterk bewaard in Deze modelorganismen zijn in detail beschreven door een groot aantal literatuur. Het belangrijkste voordeel bij het gebruik van kikkers en zebravis embryo's om de effecten van hypoxie op de ontwikkeling van gewervelde dieren te onderzoeken is dat alle processen direct kunnen worden gecontroleerd, aangezien zuurstof snel de embryo's binnentreedt. Zo, bij kikkers en zebravis, zoals in tegenstelling tot andere modelorganismen zoalsMuisembryo's, kan de invloed van een specifieke zuurstofconcentratie worden bestudeerd in het weefsel van belang, zonder rekening te houden met de aanwezigheid of het gebrek aan functionele vasculatuur.De meeste in de handel verkrijgbare opstellingen voor hypoxische incubatie hebben het nadeel van vergelijkbaar groot en met bijbehorende hoge lopende kosten. Afgezien van hun hoge initiële kosten- en gasverbruik vereist evenwicht en onderhoud van gemeenschappelijke hypoxiekamers een constante hypoxische atmosfeer tegen het gasgradiënt dat van nature in deze kamers voorkomt door hun grotere grootte en / of organisme-ademhaling. Dit vereist werk van gasfans en een koelsysteem, wat de hoeveelheid extra benodigde apparatuur verhoogt, belemmert de behendigheid van de onderzoeker en vermindert de eenvoud van de experimentele procedure. Daarentegen is de opstelling die we hier presenteren vergelijkbaar robuust, maar zeer kosteneffectief, klein, makkelijk te bepalen en f mogelijk te makenAst gas-evenwicht, stabiele hypoxische atmosfeer en eenvoudige uitwisseling van materialen en oplossingen binnen de kamer. Ons systeem kan worden gebruikt voor gebruik met een aquatisch model organisme van belang.
We hebben een hypoxische kamer geconstrueerd die handig klein is en kan daarom in een gemeenschappelijke laboratorium-incubator worden geplaatst, waardoor experimentele procedures bij elke specifieke temperatuur gemakkelijk worden toegestaan. Door de beperkte temperatuur en zuurstofconcentratie in het medium te bieden, ligt het voordeel van ons systeem tegen de in de handel verkrijgbare hypoxie-incubators in zijn kleine grootte en kostenefficiëntie. Zo kan onze setup worden opgesteld met behulp van algemene laboratoriumvoorraden beschikbaar voor de meeste onderzoekslaboratoria en vereist geen dure materialen. Daarnaast produceert onze installatie geen warmte, in tegenstelling tot de in de handel verkrijgbare hypoxia incubators, en maakt het gebruik bij temperaturen kleiner dan kamertemperatuur in een incubator geplaatst. De laSt is vooral kritisch voor het werk met koudbloedige organismen zoals kikkers en vissen waar ontwikkelings- en metabolische tarieven sterk afhankelijk zijn van temperatuur.
Zeer kosteneffectief en gemakkelijk gebouwd, onze gas-incubatiekamer is desondanks zeer veelzijdig bij het vaststellen van verschillende hypoxische of hyperoxische condities, evenals het mogelijk maken om snel en makkelijk te beheren van verschillende media en oplossingen voor een groot aantal experimentele omstandigheden. Daarnaast maakt ons systeem gebruik van een 24-putje plaat in plaats van veelgebruikte gerechten of laboratoriumtanks 10 , 11 , 12 , en laat ons systeem in een keer observatie en experimentele behandeling van meerdere mutante condities.
Om te controleren of correcte inductie van hypoxie is, hebben we de niveaus van het HIF-1a eiwit door Western blot detectie gecontroleerd. Daarnaast is het aantal proliferatiecellen voor en na incubatieN in de hypoxische kamer kan worden gebruikt om te bepalen of hypoxie in het weefsel is geïnduceerd. Deze methode is gebaseerd op onze eerder gepubliceerde resultaten 13 , waaruit blijkt dat proliferatie in embryonale retinale stamcel niche afneemt bij inductie van hypoxie. Zo hebben we het niveau van retinale stamcellen proliferatie gecontroleerd door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) toe te voegen aan het embryo-medium en het meten van de opname ervan in het DNA van nieuw prolifererende cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we een makkelijke maar robuuste nieuwe methode voorgesteld om hypoxie in te stellen die is aangepast voor gebruik met kikker- en zebravis embryo's, maar kan ook geschikt zijn voor andere aquatische organismen. Het grote voordeel van deze methode ligt in zijn eenvoud en kostenefficiëntie. Niettemin zijn de met deze methode behaalde resultaten zeer robuust. We hebben aangetoond dat hypoxie efficiënt in de kamer kan worden geïnduceerd, zowel in volledige embryo's als in specifieke weefsels – hier, re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Support from Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z van WAH en de DFG-gemeenschap KH 376 / 1-1 toegekend aan HK
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
Riferimenti
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
