रहने वाले मेंढक और ज़ेबराफिश भ्रूण में हाइपोक्सिया का प्रेरण
Summary
हम जलीय जीवों जैसे मेंढक और zebrafish भ्रूण के साथ उपयोग के लिए एक उपन्यास हाइपोक्सिक चैंबर सिस्टम पेश करते हैं। हमारी प्रणाली सरल, मजबूत, लागत प्रभावी है और विवो में हाइपोक्सिया की प्रेरणा और सहयोग और 48 घंटे तक की अनुमति देता है। हम हाइपोक्सिया की प्रभावशीलता पर नजर रखने के लिए 2 प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके पेश करते हैं।
Abstract
यहां, हम हाइपॉक्सिया प्रेरण के लिए एक उपन्यास प्रणाली का परिचय देते हैं, जिसे हमने जलीय जीवों जैसे मेंढक और ज़ेब्राफिश भ्रूण जैसे हाइपोक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया है। हमारे सिस्टम में एक साधारण सेटअप की विशेषता वाले चैम्बर शामिल होते हैं जो चुनाव के किसी भी प्रयोगात्मक समाधान में एक विशिष्ट ऑक्सीजन एकाग्रता और तापमान को बनाए रखने और बनाए रखने के लिए मजबूत है। प्रस्तुत प्रणाली बहुत लागत प्रभावी है लेकिन अत्यधिक कार्यात्मक है, यह विवो में प्रत्यक्ष प्रयोग के लिए और 48 घंटे तक विभिन्न समय-अवधि के लिए hypoxia की प्रेरण और सहयोग की अनुमति देता है।
हाइपोक्सिया के प्रभावों पर नजर रखने और अध्ययन करने के लिए, हमने दो तरीकों पर कार्य किया है – पूरे भ्रूण या विशिष्ट ऊतकों में हाइपोक्सिया-अनुक्रमिक कारक 1alpha (HIF-1α) के स्तर का माप और 5-एथिलीन -2 'द्वारा रेटिनल स्टेम सेल प्रसार का निर्धारण डीएनए में डीनोकाउराइडिन (एडीयू) निगमन HIF-1α के स्तर पूरे भ्रूण या ऊतक में सामान्य हाइपोक्सिया मार्कर के रूप में काम कर सकते हैंपसंद का, यहाँ भ्रूण रेटिना भ्रूण रेटिना के प्रजनन कोशिकाओं में ईडीयू निगमन हाइपोक्सिया प्रेरण का एक विशिष्ट उत्पादन है। इस प्रकार, हमने दिखाया है कि हाइपोक्सिक भ्रूण रेटिनल प्रजनन, मेंढक और ज़ेब्राफिश भ्रूण दोनों के 5% ऑक्सीजन के तहत 1 घंटे के ऊष्मायन के भीतर प्रसार को कम करता है।
एक बार महारत हासिल करने के बाद, हमारे सेटअप को छोटे जलीय मॉडल जीवों के साथ उपयोग करने के लिए नियुक्त किया जा सकता है, सीधे vivo प्रयोगों में, किसी भी समय की अवधि और सामान्य रूप से, हाइपोक्सिक या हाइपरॉक्सिक ऑक्सीजन एकाग्रता या किसी अन्य दिए गए गैस मिश्रण के तहत।
Introduction
हाइपोक्सिया अनुसंधान के कई अनुप्रयोग हैं इनमें रोगजनन की जांच करना और हाइपॉक्सिया 1 और तीव्र उच्च ऊंचाई वाली बीमारी 2 की विशेषता चिकित्सा स्थितियों के लिए उपचार विकसित करना शामिल है। हाइपोक्सिक तनाव ऑक्सीजन की आवश्यकता वाले सभी जीवों में प्रमुख चयापचय परिवर्तनों का कारण बनता है। Hypoxic तनाव भी भ्रूण के विकास और विकास और कई मानव रोगों के रोगजनन को प्रभावित करता है, जिसमें अंतर्ग्रहण वृद्धि प्रतिबंध 3 शामिल हैं । हाइपोक्सिक तनाव से केवल कम जन्म के वजन, भ्रूण और नवजात मृत्यु के कारण नहीं हो सकते, लेकिन वयस्क जीवन में कई जटिलताओं, जैसे कि हृदय रोग, प्रकार -2 मधुमेह, मोटापे, और उच्च रक्तचाप 4 का भी परिणाम हो सकता है। हाइपोक्सिक तनाव को अक्सर ठोस ट्यूमर के विकास के दौरान देखा जाता है, जब ट्यूमर के ऊतक को इसकी रक्त की आपूर्ति बढ़ जाती है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि विवो में हाइपोक्सिया के प्रभाव का अध्ययन करने में सक्षम हो और सीधे एम्ब्रर के दौरान योनिक विकास
विकास के दौरान हाइपोक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए नियोजित सबसे प्रसिद्ध तरीकों में हाउफोक्सिक चैम्बर में जीव के विकास माध्यम या ऊष्मायन में कोबाल्ट क्लोराइड का उपयोग होता है। कोबाल्ट क्लोराइड कृत्रिम रूप से सामान्य ऑक्सीजन एकाग्रता के तहत हाइपोक्सिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, क्योंकि इसकी प्रोटीसॉमल डिग्रेडेशन 5 , 6 , 7 को रोकने के द्वारा हाइपोक्सिया-अनुक्रमिक कारक -1 अल्फा (एचआईएफ-1α) के स्थिरीकरण में अपनी भूमिका के कारण। हालांकि, सुविधाजनक विधि 8 होने के कारण , कोबाल्ट क्लोराइड के उपयोग के साथ-साथ अन्य समान रासायनिक hypoxia mimetics कोशिकाओं और ऊतकों पर असामान्य हानिकारक प्रभाव हो सकता है, जैसे एपोपोसिस 9 । इसलिए, सामान्य विकास के दौरान जीवों में जीवों में "प्राकृतिक हिप्पॉक्सिया" को शामिल करने के लिए हाइपोसिकिक चैंबर एक बेहतर तरीका है।
जलीय पशु भ्रूण में हाइपोक्सिया लगाने के लिए एक प्रणाली विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। दोनों मेंढक और ज़ेब्राफिश अब कई जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए, साथ ही विभिन्न मानव रोगों के मॉडल के लिए जानकारीपूर्ण वर्टेब्रेट मॉडल जीव बन गए हैं। मेंढक और zebrafish भ्रूण इसके अलावा, मातृ मुआवजा की जटिलता को समाप्त करना, इसके अलावा, विकास का एक तेज़ तरीका यह संभव है कि पर्यावरणीय कारकों में हेर-फेर करना और वास्तविक समय में अंग गठन में फेनोटाइपिक परिवर्तनों का निरीक्षण किया जा सके.इसके अलावा, प्रमुख संकेत पारगमन मार्गों के कई घटक अत्यधिक संरक्षित हैं इन मॉडलों के जीवों को और साहित्य के एक बड़े शरीर द्वारा विस्तारित किया गया है। हड्डियों के विकास पर हाइपॉक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मेंढक और zebrafish भ्रूण का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि सभी प्रक्रियाओं को सीधे निगरानी की जा सकती है, क्योंकि ऑक्सीजन जल्दी से भ्रूण में प्रवेश कर लेता है। इस प्रकार, बेडूक और zebrafish में, जैसे अन्य मॉडल जीवों के विपरीतमाउस भ्रूण, एक विशिष्ट ऑक्सीजन की एकाग्रता का प्रभाव ब्याज के ऊतक में अध्ययन किया जा सकता है, बिना कार्यवाही की उपस्थिति या अभाव को ध्यान में रखते हुए।हाइपोक्सीक ऊष्मायन के लिए सबसे अधिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेटअपों का तुलनात्मक रूप से बड़े होने का नुकसान होता है और इसके चलते उच्च चलने वाली लागतें होती हैं। उनके उच्च प्रारंभिक लागत और गैस की खपत के अलावा, सामान्य हाइपोक्सिया कक्षों के संतुलन और रखरखाव के लिए गैस ढाल के खिलाफ निरंतर हाइपोक्सिक वातावरण की आवश्यकता होती है जो प्राकृतिक रूप से इन कक्षों में होती है क्योंकि उनके बड़े आकार और / या जीव श्वसन की वजह से। इसके लिए गैस के प्रशंसकों और एक शीतलन प्रणाली के रोजगार की आवश्यकता होती है, जो अतिरिक्त आवश्यक उपकरणों की मात्रा को बढ़ाती है, शोधकर्ता की निपुणता में बाधा उत्पन्न करता है और प्रयोगात्मक प्रक्रिया की संपूर्णता कम हो जाती है। इसके विपरीत, हम यहां प्रस्तुत सेटअप तुलनात्मक रूप से मजबूत हैं लेकिन बहुत लागत प्रभावी, छोटे, स्थापित करने में आसान और अनुमति देता है fअस्थायी गैस संतुलन, स्थिर हाइपोक्सिक वायुमंडल और कक्ष के भीतर सामग्री और समाधान के सरल आदान प्रदान। हमारे सिस्टम को ब्याज के किसी भी जलीय मॉडल जीव के साथ प्रयोग के लिए नियोजित किया जा सकता है।
हमने एक हाइपोक्सिक चैम्बर का निर्माण किया है जो आसानी से छोटा होता है और इसलिए इसे आम प्रयोगशाला इनक्यूबेटर के अंदर रखा जा सकता है, जो आसानी से किसी भी विशिष्ट तापमान पर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की अनुमति देता है। मध्यम में ऑक्सीजन की एकाग्रता के तापमान के साथ-साथ सुविधाजनक नियंत्रण प्रदान करना, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैल्पॉक्सिया इनक्यूबेटर के खिलाफ हमारे सिस्टम का लाभ अपने छोटे आकार और लागत दक्षता में है। इस प्रकार, हमारे सेटअप को अधिकांश प्रयोगशाला प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध सामान्य प्रयोगशाला आपूर्ति का उपयोग करके स्थापित किया जा सकता है और किसी महंगी सामग्री की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, हमारा सेटअप गर्मी उत्पन्न नहीं करता है, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हाइपोक्सिया इनक्यूबेटर के विपरीत, और इनक्यूबेटर में कमरे के तापमान से कम तापमान पर उपयोग की अनुमति देता है। लासेंट विशेष रूप से ठंडे खून वाले जीवों जैसे कि मेंढक और मछली के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है जहां विकास और चयापचय दर जोरदार तापमान निर्भर हैं।
बहुत लागत प्रभावी और आसानी से निर्मित होने के नाते, हमारे गैस इन्सुबेशन चैम्बर विभिन्न हाइपोक्सिक या हाइपरॉक्सिक स्थितियों की स्थापना के साथ-साथ विभिन्न मीडिया और समाधानों के त्वरित और आसान प्रशासन को सक्षम करने के लिए बहुत ही बहुमुखी हैं। इसके अलावा, आम तौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले व्यंजन या प्रयोगशाला टैंक 10 , 11 , 12 के बजाय 24-अच्छी तरह की थाली को नियोजित करते हुए, हमारी प्रणाली एक बार में कई उत्परिवर्ती परिस्थितियों के निरीक्षण और प्रयोगात्मक उपचार की अनुमति देती है।
हाइपोक्सिया की सही प्रेरण के लिए नियंत्रण करने के लिए, हमने पश्चिमी ब्लॉट डिटेक्शन द्वारा एचआईएफ-1 एएनटी प्रोटीन के स्तर पर नजर रखी है। इसके अलावा, इन्क्यूबेटियन से पहले और बाद में कोशिकाओं को फैलाने की संख्याहाइपोक्सिक चैंबर में एन यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ऊतक में हाइपोक्सिया को प्रेरित किया गया है या नहीं। यह विधि हमारे पहले प्रकाशित परिणामों पर आधारित है 13 , दिखा रहा है कि भ्रूण रेटिनल स्टेम सेल आला में प्रसार हाइपोक्सिया के शामिल होने पर घट जाती है। इस प्रकार, हमने भ्रूण के माध्यम से 5-एथिलीन-2'-डीनोकाउराइडिन (एडीयू) को जोड़कर रेटिनल स्टेम सेल के प्रसार के स्तर को मॉनिटर किया है और नवप्रवर्तन कोशिकाओं के डीएनए में इसके निगमन को मापने का लक्ष्य रखा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हमने हाइपोक्सिया को प्रेरित करने के लिए एक आसान लेकिन मजबूत नई विधि प्रस्तुत की है जो कि मेंढक और ज़ेब्राफिश भ्रूण के साथ उपयोग के लिए समायोजित है लेकिन यह अन्य जलीय जीवों के लिए उपयुक्त भी हो सकत?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वेलकम ट्रस्ट एसआईए पुरस्कार 100329 / जेड / 12 / जेड टू वाईएएच और डीएफजी फेलोशिप केएच 376 / 1-1 से एचक को सम्मानित किया गया।
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
Riferimenti
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