Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио
Summary
Мы вводим новую систему гипоксической камеры для использования с водными организмами, такими как эмбрионы лягушки и рыбок данио. Наша система проста, надежна, экономична и позволяет вводить и поддерживать гипоксию in vivo и до 48 часов. Мы представляем 2 воспроизводимых метода для мониторинга эффективности гипоксии.
Abstract
Здесь мы вводим новую систему индукции гипоксии, которую мы разработали для изучения эффектов гипоксии у водных организмов, таких как эмбрионы лягушки и рыбок данио. Наша система включает в себя камеру с простой установкой, которая тем не менее надежна, чтобы вызывать и поддерживать определенную концентрацию кислорода и температуру в любом выбранном экспериментальном решении. Представленная система является очень рентабельной, но очень функциональной, позволяет проводить индукцию и поддержание гипоксии для прямых экспериментов in vivo и в течение различных периодов времени до 48 часов.
Для мониторинга и изучения эффектов гипоксии мы использовали два метода – измерение уровней индуцируемого гипоксией фактора 1 альфа (HIF-1α) у целых эмбрионов или специфических тканей и определение пролиферации стволовых клеток сетчатки 5-этинил-2'- Дезоксиуридина (EdU) в ДНК. Уровни HIF-1α могут служить общим маркером гипоксии во всем эмбрионе или тканиВыбор, здесь эмбриональная сетчатка. Включение ЭДУ в пролиферирующие клетки эмбриональной сетчатки является специфическим результатом индукции гипоксии. Таким образом, мы показали, что гипоксические эмбриональные предшественники сетчатки снижают пролиферацию в течение 1 часа инкубации под 5% кислорода как эмбрионов лягушки, так и рыбок данио.
После освоения наша установка может использоваться для использования с небольшими организмами водных организмов, для прямых экспериментов in vivo , любого заданного периода времени и при нормальной, гипоксической или гипероксической концентрации кислорода или любой другой данной газовой смеси.
Introduction
Исследование Hypoxia имеет множество применений. К ним относятся исследование патогенеза и разработка методов лечения заболеваний, характеризующихся гипоксией 1 и острой больничной болезнью 2 . Гипоксический стресс вызывает значительные метаболические изменения во всех организмах, нуждающихся в кислороде. Гипоксический стресс также влияет на рост и развитие плода и патогенез нескольких заболеваний человека, включая ограничение внутриутробного роста 3 . Гипоксический стресс может не только приводить к снижению веса при рождении, плода и неонатальной смертности, но также может привести к многим осложнениям во взрослой жизни, таким как сердечно-сосудистые заболевания, диабет типа 2, ожирение и гипертония 4 . Гипоксический стресс также часто наблюдается при развитии солидной опухоли, когда опухолевая ткань перерастает в кровь. Поэтому важно иметь возможность изучать влияние гипоксии in vivo и непосредственно во время эмбриона Йонное развитие.
Среди наиболее известных методов, используемых для изучения эффектов гипоксии во время развития, является использование хлорида кобальта в среде роста или инкубация организма в гипоксической камере. Хлорид кобальта искусственно вызывает гипоксический ответ при нормальной концентрации кислорода из-за его роли в стабилизации гипоксически-индуцируемого фактора-1 альфа (HIF-1α), предотвращая его протеосомную деградацию 5 , 6 , 7 . Однако, являясь удобным методом 8 , использование хлорида кобальта, а также других аналогичных миметиков химической гипоксии может оказывать неспецифическое вредное воздействие на клетки и ткани, например , на апоптоз 9 . Поэтому гипоксические камеры являются лучшим методом индукции «естественной гипоксии» в живых организмах в процессе нормального развития.
Ntent "> Мы сосредоточились на разработке системы индукции гипоксии у эмбрионов водных животных. Как лягушки, так и рыбки данио теперь стали информативными модельными организмами-позвоночных для изучения многочисленных биологических процессов, а также моделей для различных заболеваний человека. Зародыши лягушек и рыбок данио Развиваются внешне, устраняя усложнение материнской компенсации. Кроме того, быстрый курс развития позволяет манипулировать факторами окружающей среды и наблюдать фенотипические изменения в формировании органов в реальном времени. Кроме того, многие компоненты основных путей передачи сигналов в значительной степени сохраняются в Эти модельные организмы и были подробно охарактеризованы большим объемом литературы. Главное преимущество использования лягушек и эмбрионов рыбок данио для изучения влияния гипоксии на развитие позвоночных заключается в том, что все процессы можно контролировать напрямую, так как кислород быстро проникает в эмбрионы. Таким образом, у лягушек и данио, как в отличие от других модельных организмов, таких какМышиные эмбрионы, влияние удельной концентрации кислорода можно исследовать в интересующей ткани, не принимая во внимание наличие или отсутствие функциональной сосудистой сети.Большинство коммерчески доступных установок для гипоксической инкубации имеют недостаток в том, что они сравнительно большие и имеют соответственно высокие эксплуатационные расходы. Помимо высокой начальной стоимости и потребления газа, уравновешивание и поддержание общих гипоксических камер требует поддержания постоянной гипоксической атмосферы против газового градиента, который естественным образом возникает в этих камерах из-за их более крупного размера и / или дыхания организма. Это требует использования газовых вентиляторов и системы охлаждения, что увеличивает количество дополнительного необходимого оборудования, затрудняет ловкость исследователя и в целом снижает простоту экспериментальной процедуры. Напротив, установка, представленная здесь, является сравнительно надежной, но очень рентабельной, небольшой, простой в установке и позволяет fГазового равновесия, стабильной гипоксической атмосферы и простого обмена материалами и растворами внутри камеры. Наша система может использоваться для использования с любым интересующим организмом водной модели.
Мы построили гипоксическую камеру, которая удобно мала и поэтому может быть помещена в общий лабораторный инкубатор, что легко позволяет экспериментальные процедуры при любой определенной температуре. Обеспечивая удобное управление температурой, а также концентрацию кислорода в среде, преимущество нашей системы против коммерчески доступных инкубаторов гипоксии заключается в ее небольших размерах и экономической эффективности. Таким образом, наша установка может быть установлена с использованием общих лабораторных материалов, доступных для большинства исследовательских лабораторий, и не требует каких-либо дорогостоящих материалов. Кроме того, наша установка не генерирует тепло, в отличие от коммерчески доступных инкубаторов гипоксии, и позволяет использовать при температурах ниже комнатной температуры, размещенных в инкубаторе. The laSt особенно важна для работы с хладнокровными организмами, такими как лягушки и рыба, где скорости развития и метаболизма сильно зависят от температуры.
Будучи очень экономичной и легко построенной, наша камера газового инкубатора, тем не менее, очень универсальна при установлении различных гипоксических или гипероксических условий, а также позволяет быстро и легко вводить различные среды и растворы для огромного количества экспериментальных условий. Кроме того, с использованием 24-луночного планшета вместо обычно используемых блюд или лабораторных резервуаров 10 , 11 , 12 наша система позволяет наблюдать и экспериментально обрабатывать несколько условий мутанта сразу.
Чтобы контролировать правильную индукцию гипоксии, мы контролировали уровни белка HIF-1α путем вестерн-блот-детектирования. Кроме того, количество пролиферирующих клеток до и после инкубацииN в гипоксической камере можно использовать для определения того, была ли индуцирована гипоксия в ткани. Этот метод основан на наших ранее опубликованных результатах 13 , свидетельствующих о том, что при индукции гипоксии снижается пролиферация в нише стволовых клеток эмбриональной сетчатки. Таким образом, мы контролировали уровень пролиферации стволовых клеток сетчатки путем добавления 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) к среде эмбриона и измерения его включения в ДНК вновь пролиферирующих клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представили простой, но прочный новый метод для индуцирования гипоксии, который приспособлен для использования с эмбрионами лягушки и данио, но может также быть подходящим для других водных организмов. Основным преимуществом этого метода является его простота и экономичност…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана поддержкой от Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z до WAH и стипендией DFG KH 376 / 1-1, присужденной HK
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
Riferimenti
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
