Inducción de la hipoxia en los sapos vivos y los embriones de pez cebra
Summary
Introducimos un nuevo sistema de cámara hipóxico para su uso con organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema es simple, robusto, rentable y permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia in vivo y hasta 48 horas. Presentamos 2 métodos reproducibles para monitorear la efectividad de la hipoxia.
Abstract
Aquí, introducimos un nuevo sistema para la inducción de hipoxia, que desarrollamos para estudiar los efectos de la hipoxia en organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema comprende una cámara con una instalación sencilla pero que es, sin embargo, robusta para inducir y mantener una concentración específica de oxígeno y temperatura en cualquier solución experimental de elección. El sistema presentado es muy rentable pero altamente funcional, permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia para experimentos directos in vivo y durante varios periodos de tiempo de hasta 48 h.
Para monitorear y estudiar los efectos de la hipoxia, se han empleado dos métodos – la medición de los niveles de hipoxia inducible factor 1alfa (HIF-1α) en embriones enteros o tejidos específicos y la determinación de la proliferación de células madre retinianas por 5-etinil-2'- Desoxiuridina (EdU) en el ADN. Los niveles de HIF-1 alpha pueden servir como un marcador general de hipoxia en todo el embrión o tejidoDe elección, aquí la retina embrionaria. La incorporación de EDU en las células proliferantes de la retina embrionaria es un resultado específico de la inducción de hipoxia. Por lo tanto, hemos demostrado que hypoxic progenitores de la retina embrionaria disminuir la proliferación dentro de 1 h de incubación en el 5% de oxígeno de la rana y el pez cebra embriones.
Una vez dominado, nuestro sistema se puede emplear para el uso con micro organismos acuáticos pequeños, para experimentos directos in vivo , en cualquier período de tiempo dado y bajo concentración de oxígeno normal, hipóxico o hiperóxico o bajo cualquier otra mezcla de gases dada.
Introduction
La investigación de la hipóxia tiene numerosas aplicaciones. Estos incluyen la investigación de la patogénesis y el desarrollo de tratamientos para condiciones médicas que se caracterizan por la hipoxia 1 y la enfermedad de alta altitud aguda 2 . El estrés hipóxico causa importantes cambios metabólicos en todos los organismos que requieren oxígeno. Estrés hipóxico también influye en el crecimiento fetal y el desarrollo y la patogénesis de varias enfermedades humanas, incluida la restricción de crecimiento intrauterino [ 3] . El estrés hipóxico puede no sólo conducir a la reducción del peso al nacer, la mortalidad fetal y neonatal, sino que también puede dar lugar a muchas complicaciones en la vida adulta, como las enfermedades cardiovasculares, la diabetes tipo 2, la obesidad y la hipertensión 4 . El estrés hipóxico también se observa a menudo durante el desarrollo del tumor sólido, cuando el tejido tumoral supera su suministro de sangre. Por lo tanto, es crucial para poder estudiar los efectos de la hipoxia in vivo y directamente durante el embrión Desarrollo yónico.
Entre los métodos más conocidos que se han empleado para estudiar los efectos de la hipoxia durante el desarrollo es el uso de cloruro de cobalto en el medio de crecimiento o la incubación del organismo en una cámara hipóxica. El cloruro de cobalto induce artificialmente una respuesta hipóxica bajo concentración normal de oxígeno, debido a su papel en la estabilización del factor-1 alfa inducible por hipoxia (HIF-1α) al prevenir su degradación proteosómica 5 , 6 , 7 . Sin embargo, siendo un método conveniente 8 , el uso de cloruro de cobalto así como otros similares miméticos de hipoxia química pueden tener un efecto deletéreo inespecífico en células y tejidos, por ejemplo , apoptosis 9 . Por lo tanto, las cámaras hipóxicas son un mejor método para la inducción de "hipoxia natural" en organismos vivos a través del desarrollo normal.
Ntent "> Nos hemos centrado en el desarrollo de un sistema para la inducción de la hipoxia en los embriones de animales acuáticos.Las ranas y el pez cebra se han convertido en organismos informativos modelo de vertebrados para los estudios de numerosos procesos biológicos, así como los modelos de diversas enfermedades humanas. Además, un desarrollo rápido permite manipular factores ambientales y observar los cambios fenotípicos en la formación de órganos en tiempo real. Además, muchos componentes de las principales vías de transducción de señales están altamente conservados en Estos organismos modelo y se han caracterizado en detalle por un gran cuerpo de la literatura.La principal ventaja en el uso de ranas y embriones de pez cebra para estudiar los efectos de la hipoxia en el desarrollo de vertebrados es que todos los procesos pueden ser controlados directamente, ya que el oxígeno penetra rápidamente en los embriones. Así, en las ranas y el pez cebra, como en contraste con otros organismos modelo tales comoEmbriones de ratón, se puede estudiar la influencia de una concentración específica de oxígeno en el tejido de interés, sin tener en cuenta la presencia o ausencia de vasculatura funcional.La mayoría de las configuraciones comercialmente disponibles para la incubación hipóxica tienen la desventaja de ser comparativamente grandes y tener costes de funcionamiento correspondientemente altos. Aparte de su alto costo inicial y consumo de gas, el equilibrio y el mantenimiento de las cámaras comunes de hipoxia requiere el mantenimiento de una atmósfera hipóxica constante contra el gradiente de gas que ocurre naturalmente en estas cámaras debido a su mayor tamaño y / o respiración del organismo. Esto requiere el empleo de ventiladores de gas y un sistema de refrigeración, lo que aumenta la cantidad de equipo adicional necesario, impide la destreza del investigador y en general disminuye la simplicidad del procedimiento experimental. En contraste, la configuración que presentamos aquí es comparativamente robusta pero muy rentable, pequeña, fácil de establecer y permite fEquilibrio de gases, una atmósfera hipóxica estable y un simple intercambio de materiales y soluciones dentro de la cámara. Nuestro sistema puede emplearse para su uso con cualquier organismo modelo acuático de interés.
Hemos construido una cámara hipóxica que es convenientemente pequeña y por lo tanto se puede colocar dentro de una incubadora de laboratorio común, lo que permite fácilmente procedimientos experimentales a cualquier temperatura específica. Proporcionando un control conveniente de la temperatura así como la concentración de oxígeno en el medio, la ventaja de nuestro sistema frente a las incubadoras de hipoxia comercialmente disponibles reside en su pequeño tamaño y rentabilidad. Por lo tanto, nuestra configuración puede establecerse utilizando suministros generales de laboratorio disponibles para la mayoría de los laboratorios de investigación y no requiere materiales caros. Además, nuestra instalación no genera calor, a diferencia de las incubadoras de hipoxia comercialmente disponibles, y permite su uso a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente que se colocan en una incubadora. El laSt es especialmente crítico para el trabajo con organismos de sangre fría tales como ranas y peces donde las tasas de desarrollo y metabólicas son fuertemente dependientes de la temperatura.
Al ser muy rentable y de fácil construcción, nuestra cámara de incubación de gas es sin embargo muy versátil en el establecimiento de diversas condiciones hipóxicas o hiperóxicas, así como permite la administración rápida y fácil de diferentes medios y soluciones para un gran número de condiciones experimentales. Además, empleando una placa de 24 pocillos en lugar de platos de uso común o tanques de laboratorio 10 , 11 , 12 , nuestro sistema permite la observación y el tratamiento experimental de varias condiciones mutantes a la vez.
Para controlar la correcta inducción de la hipoxia, hemos monitorizado los niveles de la proteína HIF-1 α por Western blot detección. Además, el número de células que proliferan antes y después de la incubaciónN en la cámara hipóxica se puede utilizar para determinar si se ha inducido hipoxia en el tejido. Este método se basa en nuestros resultados previamente publicados 13 , que muestran que la proliferación en el nicho embrionario de células madre retina disminuye a la inducción de la hipoxia. Por lo tanto, hemos monitoreado el nivel de proliferación de células madre retinianas añadiendo 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) al medio embrionario y midiendo su incorporación en el ADN de células que proliferan recientemente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos presentado un nuevo pero fácil método robusto para inducir hipoxia que se ajusta para su uso con los embriones de sapo y pez cebra, pero también puede ser adecuado para otros organismos acuáticos. La principal ventaja de este método reside en su simplicidad y rentabilidad. Sin embargo, los resultados obtenidos con este método son muy robustos. Hemos demostrado que la hipoxia puede ser inducida eficientemente en la cámara tanto en embriones enteros como en tejido específico – aquí, retinas. Para dete…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Premio de Apoyo Wellcome Trust SIA 100329 / Z / 12 / Z a WAH y la beca de DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
Riferimenti
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